Susceptibilidad genética a la espondilitis anquilosante (AS) por enfoque de genómica funcional (GENOSPA)

Este es un estudio de casos y controles emparejados para identificar los factores genéticos de susceptibilidad a la espondilitis anquilosante (EA).

Los pacientes y los controles familiares seleccionados de 154 familias se incluyeron en la detección de enlaces de todo el genoma, que comprende 440 pacientes y 904 individuos genotipados utilizando microarrays Affymetrix® 250,000 polimorfismo de un solo nucleótido (SNP). Para cada locus, se retuvieron las familias con una puntuación LOD de 0;15 en la región predefinida. En estas familias se seleccionará un paciente y un control sano del mismo sexo, a ser posible, hermanos y de edad comparable (<10 años de diferencia).

Los pacientes y controles serán contactados por correo y/o teléfono para obtener su participación en este estudio. Se les enviará un Cuestionario de actualización de eventos de SA, en particular para comprobar que los controles familiares no desarrollaron SA desde su inclusión en el estudio genético.

Durante el primer año se realizarán controles de reclutamiento y obtención de células dendríticas (CD) de pacientes y familiares.

Tras la firma del consentimiento informado, se tomarán 60ml de sangre total de cada sujeto incluido. Las células obtenidas de las muestras de sangre (leucocitos) se cultivarán en el laboratorio durante siete días y se utilizarán para extraer el ARN que se utilizará para realizar la investigación. Algunas de estas células, así como su ARN, se congelarán y se pueden descongelar para su uso posterior si es necesario.

Las células mononucleares se aíslan de la sangre entera mediante centrifugación en gradiente (Ficoll). Los monocitos CD14+ se seleccionarán después de marcarlos con un anticuerpo anti-CD14 acoplado a perlas ferromagnéticas (Dynabeads) y al sistema magnético Dynal, luego se diferenciarán en presencia de GM-CSF (Factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos) e IL-4 (Interleucina 4 ) durante 6 días en DC inmaduras (células dendríticas), según protocolo validado en laboratorio y utilizado en rutina. A continuación, se induce la maduración de DC mediante la adición de lipopolisacárido E. coli (Sigma) durante 18 horas. Los gránulos de DC se conservarán en RNAlater® para extraer el ARN.

Se llevará a cabo un estudio transcriptómico de CD maduras al final del reclutamiento y tendrá una duración de dos meses, incluido un mes de experimentación y 1 mes de análisis. Este estudio se realizará utilizando micromatrices de expresión centrada en el exón de todo el genoma. Los análisis se realizarán por separado para cada locus de interés y se referirán a la expresión de genes localizados en cada región. El nivel de transcripciones se normalizará para los controles de pacientes y familiares en comparación con el de un grupo de 15 controles de la población general ya obtenido. Para cada locus se identificarán genes que tengan una expresión estadísticamente diferente entre el grupo de pacientes y los controles familiares y una expresión diferencial ≥ 1. El nivel de expresión de estos genes se verificará luego mediante PCR cuantitativa en tiempo real (reacción en cadena de la polimerasa).

Los genes candidatos posicionales y funcionales identificados debido a una expresión diferencial de sus transcritos serán completamente resecuenciados para buscar polimorfismos que puedan ser responsables de un cambio en su nivel de expresión.

Los investigadores esperan estudiar de uno a tres genes por región. La re-secuenciación se realizará principalmente en pacientes y controles familiares con diferente nivel de expresión de estos genes. Los polimorfismos distribuidos de forma diferente entre estas dos poblaciones se conservarán durante el resto del estudio.

La re-secuenciación de estos genes candidatos se extenderá en un período de 4 meses.