Suscettibilità genetica alla spondilite anchilosante (AS) mediante approccio di genomica funzionale (GENOSPA)

Questo è uno studio caso-controllo abbinato per identificare i fattori di suscettibilità genetica alla spondilite anchilosante (AS).

Pazienti e controlli familiari selezionati da 154 famiglie sono stati inclusi nello screening di collegamento genome-wide, comprendente 440 pazienti e 904 individui genotipizzati utilizzando microarray Affymetrix® 250.000 polimorfismo a singolo nucleotide (SNP). Per ogni locus, sono state mantenute le famiglie con un punteggio LOD di 0,15 nella regione predefinita. In queste famiglie verranno selezionati un paziente e un controllo sano dello stesso sesso, possibilmente fratelli e di età comparabile (<10 anni di distanza).

I pazienti ei controlli saranno contattati via mail e/o telefono per ottenere la loro partecipazione a questo studio. A loro verrà inviato un Questionario di aggiornamento degli eventi di AS, in particolare per verificare che i controlli familiari non abbiano sviluppato AS dal loro inserimento nello studio genetico.

Il reclutamento dei pazienti e dei controlli familiari e l'ottenimento delle loro cellule dendritiche (DC) saranno effettuati durante il primo anno.

Dopo aver firmato il consenso informato, verranno prelevati 60 ml di sangue intero da ciascun soggetto incluso. Le cellule ottenute da campioni di sangue (leucociti) saranno coltivate in laboratorio per sette giorni e utilizzate per estrarre l'RNA che servirà per condurre la ricerca. Alcune di queste cellule così come il loro RNA saranno congelate e potranno essere scongelate per un uso successivo, se necessario.

Le cellule mononucleate sono isolate dal sangue intero mediante centrifugazione in gradiente (Ficoll). I monociti CD14+ saranno selezionati dopo marcatura con un anticorpo anti-CD14 accoppiato a biglie ferromagnetiche (Dynabeads) e al sistema magnetico Dynal, quindi differenziati in presenza di GM-CSF (Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor) e IL-4 (Interleukine 4 ) per 6 giorni nelle DC immature (cellule dendritiche), secondo un protocollo validato in laboratorio e utilizzato nella routine. La maturazione delle DC viene quindi indotta dall'aggiunta di lipopolisaccaride E. coli (Sigma) per 18 ore. I pellet di DC saranno conservati in RNAlater® per l'estrazione dell'RNA.

Alla fine del reclutamento verrà condotto uno studio trascrittomico delle DC mature e durerà due mesi, di cui un mese di sperimentazione e 1 mese di analisi. Questo studio sarà condotto utilizzando microarray di espressione esone-centrica su tutto il genoma. Le analisi saranno effettuate separatamente per ciascun locus di interesse e riguarderanno l'espressione di geni localizzati in ciascuna regione. Il livello dei trascritti sarà normalizzato per pazienti e controlli familiari rispetto a quello di un gruppo di 15 controlli della popolazione generale già ottenuto. Per ogni locus verranno identificati geni con espressione statisticamente diversa tra il gruppo di pazienti ei controlli familiari ed espressione differenziale ≥ 1. Il livello di espressione di questi geni sarà poi verificato mediante PCR (reazione a catena della polimerasi) quantitativa in tempo reale.

I geni candidati posizionali e funzionali identificati a causa di un'espressione differenziale dei loro trascritti saranno completamente risequenziati per ricercare polimorfismi che potrebbero essere responsabili di un cambiamento nel loro livello di espressione.

I ricercatori prevedono di studiare da uno a tre geni per regione. Il risequenziamento sarà eseguito principalmente in pazienti e controlli familiari con un diverso livello di espressione di questi geni. I polimorfismi distribuiti in modo diverso tra queste due popolazioni verranno mantenuti per il resto dello studio.

Il risequenziamento di questi geni candidati sarà distribuito su un periodo di 4 mesi.