A spondylitis ankylopoetica (AS) iránti genetikai érzékenység funkcionális genomikai megközelítéssel (GENOSPA)

Ez egy párosított eset-kontroll vizsgálat a spondylitis ankylopoetica (AS) genetikai érzékenységi tényezőinek azonosítására.

A 154 családból kiválasztott betegek és családkontrollok részt vettek a genomszintű kapcsolati szűrésben, amely 440 beteget és 904 egyént foglal magában, akiknek genotipizálása Affymetrix® 250 000 egynukleotid polimorfizmus (SNP) microarray segítségével történt. Minden egyes lókusz esetében megtartottuk azokat a családokat, amelyek LOD pontszáma 0;15 volt az előre meghatározott régióban. Ezekben a családokban egy beteget és egy azonos nemű, egészséges kontrollt, lehetőség szerint testvéreket és hasonló korú (<10 év különbséggel) választanak ki.

A betegekkel és a kontrollcsoportokkal e-mailben és/vagy telefonon felvesszük a kapcsolatot a vizsgálatban való részvételük érdekében. Frissítő kérdőívet küldenek nekik az AS-eseményekről, különösen annak ellenőrzésére, hogy a családi kontrollok nem fejlesztettek-e ki AS-t a genetikai vizsgálatba való felvételük óta.

A betegek és családtagok toborzása és dendritikus sejtjeik (DC) beszerzése az első évben történik.

A beleegyező nyilatkozat aláírása után 60 ml teljes vért veszünk minden érintett személytől. A vérmintákból nyert sejteket (leukocitákat) hét napig tenyésztik a laboratóriumban, és a kutatáshoz felhasznált RNS kinyerésére használják. Ezen sejtek egy részét, valamint RNS-üket lefagyasztják, és szükség esetén későbbi felhasználásra felolvasztják.

A mononukleáris sejteket a teljes vérből gradiens centrifugálással (Ficoll) izoláljuk. A CD14 + monocitákat ferromágneses gyöngyökhöz (Dynabeads) és a Dynal mágnesrendszerhez kapcsolt anti-CD14 antitesttel történő jelölés után választják ki, majd GM-CSF (Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor) és IL-4 (Interleukin 4) jelenlétében differenciálják őket. ) 6 napig éretlen DC-be (dendritikus sejtek), a laboratóriumban validált és rutinszerűen használt protokoll szerint. Ezután a DC érést indukáljuk lipopoliszacharid E. coli (Sigma) hozzáadásával 18 órán keresztül. A DC pelleteket az RNAlater®-ben tartják az RNS extrahálásához.

Az érett DC-k transzkriptomikus vizsgálatát a toborzás végén végezzük, és két hónapig tart, beleértve egy hónap kísérletezést és 1 hónap elemzést. Ezt a vizsgálatot az egész genomra kiterjedő exoncentrikus expressziós mikrotömbök felhasználásával végezzük. Az elemzéseket minden egyes érdeklődésre számot tartó lókuszra külön-külön végzik el, és az egyes régiókban lokalizált gének expressziójára vonatkoznak. A transzkriptumok szintjét normalizálják a betegek és a családi kontrollok esetében, összehasonlítva a már kapott általános populáció 15 kontrollcsoportjával. Minden egyes lókusznál azonosítani kell azokat a géneket, amelyek statisztikailag eltérő expressziót mutatnak a betegek csoportja és a család kontrolljai között, és az expresszió különbsége ≥ 1. Ezeknek a géneknek az expressziós szintjét ezután kvantitatív valós idejű PCR-rel (polimeráz láncreakció) ellenőrizzük.

A transzkriptumaik eltérő expressziója miatt azonosított pozíciós és funkcionális jelöltgének teljesen újraszekvenálódnak, hogy olyan polimorfizmusokat keressenek, amelyek felelősek lehetnek az expressziós szintjük megváltozásáért.

A kutatók régiónként egy-három gén vizsgálatát várják. Az újbóli szekvenálást elsősorban olyan betegeknél és családi kontrolloknál hajtják végre, akiknél ezek a gének eltérő mértékben expresszálódnak. A két populáció között eltérően megoszló polimorfizmusokat a vizsgálat hátralévő részében megtartjuk.

Ezeknek a jelölt géneknek az újbóli szekvenálása 4 hónapig terjed.