Genetyczna podatność na zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa (ZZSK) metodą funkcjonalnej genomiki (GENOSPA)

Jest to dopasowane badanie kliniczno-kontrolne mające na celu identyfikację genetycznych czynników podatności na zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa (ZZSK).

Pacjenci i kontrole rodzinne wybrane spośród 154 rodzin zostały włączone do badania przesiewowego powiązań całego genomu, obejmującego 440 pacjentów i 904 osobników, których genotypowano przy użyciu mikromacierzy Affymetrix® 250 000 polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP). Dla każdego locus zachowano rodziny z wynikiem LOD 0; 15 w predefiniowanym regionie. W tych rodzinach zostanie wybrany pacjent i zdrowa kontrola tej samej płci, jeśli to możliwe, rodzeństwo iw porównywalnym wieku (w odstępie <10 lat).

Z pacjentami i grupą kontrolną skontaktujemy się pocztą i/lub telefonicznie w celu uzyskania ich udziału w tym badaniu. Zostanie do nich wysłany aktualizujący Kwestionariusz zdarzeń AS, w szczególności w celu sprawdzenia, czy w grupie kontrolnej rodziny nie rozwinął się zespół Aspergera od czasu włączenia ich do badania genetycznego.

Rekrutacja i pozyskiwanie komórek dendrytycznych (DC) pacjentów i rodzin zostanie przeprowadzona w ciągu pierwszego roku.

Po podpisaniu świadomej zgody od każdego zakwalifikowanego pacjenta zostanie pobrane 60 ml pełnej krwi. Komórki pozyskane z próbek krwi (leukocyty) będą hodowane w laboratorium przez siedem dni i wykorzystane do ekstrakcji RNA, które posłuży do prowadzenia badań. Niektóre z tych komórek oraz ich RNA zostaną zamrożone iw razie potrzeby można je rozmrozić do późniejszego wykorzystania.

Komórki jednojądrzaste są izolowane z pełnej krwi przez wirowanie w gradiencie (Ficoll). Monocyty CD14+ zostaną wyselekcjonowane po znakowaniu przeciwciałem anty-CD14 sprzężonym z kulkami ferromagnetycznymi (Dynabeads) i układem magnetycznym Dynal, a następnie różnicowane w obecności GM-CSF (czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów makrofagów) i IL-4 (interleukina 4 ) przez 6 dni do niedojrzałych DC (komórek dendrytycznych), zgodnie z protokołem zwalidowanym w laboratorium i stosowanym rutynowo. Następnie indukuje się dojrzewanie DC przez dodanie lipopolisacharydu E. coli (Sigma) na 18 godzin. Osady DC zostaną zatrzymane w RNAlater® w celu ekstrakcji RNA.

Badanie transkryptomiczne dojrzałych DC zostanie przeprowadzone pod koniec rekrutacji i potrwa dwa miesiące, w tym jeden miesiąc eksperymentów i 1 miesiąc na analizę. Badanie to zostanie przeprowadzone przy użyciu mikromacierzy ekspresji skoncentrowanej na eksonie w całym genomie. Analizy zostaną przeprowadzone oddzielnie dla każdego locus będącego przedmiotem zainteresowania i będą dotyczyły ekspresji genów zlokalizowanych w każdym regionie. Poziom transkryptów zostanie znormalizowany dla kontroli pacjentów i rodzin w porównaniu z grupą 15 kontroli z już uzyskanej populacji ogólnej. Dla każdego locus zostaną zidentyfikowane geny mające statystycznie różną ekspresję między grupą pacjentów a grupą kontrolną rodziny oraz zróżnicowaną ekspresję ≥ 1. Poziom ekspresji tych genów zostanie następnie zweryfikowany przez ilościową reakcję PCR w czasie rzeczywistym (reakcja łańcuchowa polimerazy).

Kandydujące geny pozycyjne i funkcjonalne zidentyfikowane dzięki zróżnicowanej ekspresji ich transkryptów zostaną w pełni ponownie zsekwencjonowane w celu wyszukania polimorfizmów, które mogą być odpowiedzialne za zmianę poziomu ich ekspresji.

Badacze spodziewają się zbadać od jednego do trzech genów na region. Ponowne sekwencjonowanie zostanie przeprowadzone przede wszystkim u pacjentów i rodzin kontrolnych o różnym poziomie ekspresji tych genów. Polimorfizmy rozłożone w różny sposób między tymi dwiema populacjami zostaną zachowane do końca badania.

Ponowne sekwencjonowanie tych kandydujących genów zostanie rozłożone na okres 4 miesięcy.