Enkapseloidun glukoraphaniinin muuntaminen, suoliston mikrobiston fysiologia ja gEnotyyppitutkimus (ENGAGE) (ENGAGE)

Glukosinolaatit (GSL) ovat haihtumattomia rikkiä sisältäviä fytokemikaaleja (sekundaarisia aineenvaihduntatuotteita), joita löytyy ristikukkaisten kasvien, kuten parsakaalin, kaalin ja vesikrassin, kasvikudoksesta. Näihin elintarvikkeisiin kertyy glukosinolaatteja, ja glukorafaniini on pääasiallinen glukosinolaatti, jota löytyy parsakaalista. Kun kudos hajoaa, glukosinolaatit muunnetaan isotiosyanaateiksi (ITC:iksi) myrosinaasientsyymin vaikutuksesta. Sulforafaani on hallitseva ITC, joka saadaan entsymaattisella hydrolyysillä glukorafaniinista. Kun vihannekset kypsennetään hyvin perusteellisesti, myrosinaasientsyymi denaturoituu, mikä johtaa siihen, että GSL:t kulkevat maha-suolikanavan (GI) kautta paksusuoleen.

ITC:illä on eläinkokeissa osoitettu olevan erilaisia ​​biologisia vaikutuksia, kuten antioksidanttisia vaikutuksia; anti-inflammatoriset ominaisuudet; verihiutaleiden aggregaation estäminen; systolisen verenpaineen alentaminen ja kolesterolitason alentaminen; jotka kaikki vähentävät riskiä sairastua sydän- ja verisuonisairauksiin. Sulforafaanin on yhdistetty ihmisten terveyshyötyihin, kuten syövän ehkäisyyn ja terveen sydämen ylläpitämiseen.

Kun syödään keitettyjä ristikukkaisia ​​vihanneksia, joissa myrosinaasientsyymi on inaktivoitu, osa paksusuolen mikrofloorasta tuottaa myrosinaasin kaltaista entsyymiä, joka voi myös muuttaa glukosinolaatteja ITC:iksi. Tämä prosessi, jossa glukorafaniinin mikrobiot muuttuvat ITC:ksi, poistetaan enteroantibioottien ja suolen puhdistuksen avulla. Sekä puhtailla bakteeriviljelmillä että sekaviljelmillä on suoritettu useita in vitro -tutkimuksia, jotka vahvistavat ihmisen suolistossa olevien bakteerikantojen kyvyn metaboloida GSL:itä viljelmässä. On osoitettu, että ihmisen suoliston mikrobiotassa GSL:ien muuntaminen ITC:ksi vaihtelee suuresti yksilöiden välillä, mutta yksilöiden sisällä tehdyistä toistuvista määrityksistä saatu konversioprosentti on paljon johdonmukaisempi. Äskettäisessä tutkimuksessa yritettiin korreloida glukosinolaatin muuntumista ex vivo ihmisen suolistobakteerien toimesta glukosinolaatin metaboliaa koskeviin in vivo -tietoihin pienestä määrästä yksilöitä, mutta mitään erityistä yhteyttä yksittäisiin bakteereihin ei löydetty.

Tutkimuksemme on ihmisen ruokavaliointerventio, jossa osallistujat nauttivat yhden kapselin, joka sisältää 100 mg puhdistettua glukorafaniinia parsakaalista. Kapselin toimittaman glukorafaniinin määrät ovat samanlaiset kuin 1-2 annosta parsakaalia. Koska tämä on puhdistettua glukorafaniinia, siinä ei ole myrosinaasientsyymiä. Kaikki kapselin sisältämän glukorafaniinin muuntaminen ITC:ksi tapahtuu siten suoliston mikrobiotosta löytyvien entsyymien toimesta.

Kapselissa olevan glukorafaniinin kykyä metaboloitua ITC:iksi suoliston mikroflooran toimesta ei tunneta, ja se arvioidaan mittaamalla virtsaan erittyneiden ITC:iden määrä. Lyhyesti sanottuna jokaista tutkimukseen osallistuvaa pyydetään pidättäytymään kaikista glukosinolaattia ja ITC:tä sisältävistä elintarvikkeista kolmen päivän ajan ennen ruokavalioon ryhtymistä ja vielä 24 tunnin ajan toimenpiteen aikana. Heitä pyydetään paastoamaan yön yli ennen tutkimuspäivän interventiota ja paaston jälkeisenä aamuna ottamaan virtsanäyte. Tämä muodostaa tehokkaasti negatiivisen kontrollinäytteen, ja sitä käytetään ruokavalion rajoituksen noudattamisen mittana. Osallistujalle annetaan sitten glukorafaniinikapseli aamiaisen mukana. Ruokavaliorajoitus jatkuu vielä 24 tuntia, jonka aikana osallistuja kerää kaiken tuottamansa virtsan. ITC:t määritetään virtsasta HP-LC:llä ja LC-MS:llä käyttäen validoituja analyyttisiä menetelmiä. Kun 24 tunnin virtsankeruu on valmis, ruokavaliorajoitus lakkaa.

Ihmisten ruokavaliointerventiotutkimuksissa on osoitettu, että glukosinolaattien muuntumisaste vaihtelee suuresti. Glukorafaniinin aineenvaihdunnan vaihteluiden mahdollisten syytekijöiden arvioimiseksi jokainen osallistuja toimittaa ulostenäytteen, josta hänen ulosteen suolen mikrobiotan fysiologia analysoidaan. Yksityiskohtainen kuvaus siitä, kuinka näyte tulee kerätä, sekä kaikki tarvittavat laitteet toimitetaan. Ulostenäytteet palautetaan tutkijalle kahden tunnin kuluessa tuotannosta ulostebakteerien elinkyvyn ylläpitämiseksi.

Pienelle osallistujamäärälle pyydetään toinen ulostenäyte (enintään 3 osallistujaa). Tavoitteena on valita yksi matala, yksi keskikokoinen ja yksi korkea ITC-eritin. Ihannetapauksessa alhaiset ja korkeat erittäjät olisivat alimman ja suurimman 5 %:n ITC-erityksen sisällä ja kolmas osallistuja on mahdollisimman lähellä keskimääräistä ITC-eritystä. Tavoitteena on viljellä ulosteen mikrobiota ajan mittaan toistuvalla glukorafaniiniannostelulla glukorafaniinia metaboloimaan kykenevän mikrobiston valikoimiseksi. Tiedetään, että glukorafaanin pääasiallisella hydrolyysituotteella, sulforafaanilla, on monia etuja ihmisten terveydelle, mutta ei ole tunnettua kliinistä merkitystä sillä, että se on suuri, keskitasoinen tai vähäinen ITC:n erittäjä.

Useat epidemiologiset ja interventiotutkimukset viittaavat siihen, että ristikukkaisten vihannesten terveyshyötyjä ja fysiologisia vasteita voi välittää yksilön GSTM1-genotyyppi (glutationi-S-transferaasien (GST) geeniperhe). Kun ITC:t imeytyvät kehoon, ne konjugoituvat glutationin kanssa ja metaboloituvat sitten merkaptuurihapporeitin kautta. Konjugaatio tapahtuu spontaanisti johtuen suhteellisen korkeasta glutationin pitoisuudesta soluissa verrattuna ITC-pitoisuuteen. Koska plasmassa esiintyy konjugoimattomia ITC:itä, ITC-tiolikonjugaatin täytyy kuitenkin jossain vaiheessa dissosioitua. Uskotaan, että GSTM1-entsyymi voi katalysoida tätä. Noin 50 %:lla populaatiosta on homologinen GSTM1-geenin deleetio, joka johtaa nollagenotyyppiin, ja 20 %:lla on GSTT1-geenin deleetio. Jotkut tutkimukset, mukaan lukien yksi omamme, viittaavat siihen, että GSTM1-genotyyppi voi vaikuttaa ITC:n erittymisnopeuteen virtsaan, mutta ne eivät ole osoittaneet, että GSTM1-genotyyppi vaikuttaisi plasman huippupitoisuuteen.

Julkaisemattomat tulokset aikaisemmasta interventiosta, Diet and Vascular Health -tutkimuksesta; Clinical Trials.gov: NCT01114399 on lisännyt uskottavuutta ajatukselle, että GSTM1-nollat ​​metaboloivat sulforafaania eri tavalla kuin ne, joilla on toiminnallinen GSTM1-alleeli. GST-geeniperheen ja niiden yhdistämisen ristikukkaisten vihannesten kanssa voi olla muita kiinnostavia geenejä, jotka voivat kyetä määrittämään glukorafaanin konversion määrän sulforafaaniksi. Edellisessä interventiossamme, Diet and Vascular Health -tutkimuksessa, tehty työ on pyrkinyt tutkimaan mahdollisia ehdokasgeenejä. Huomattavalla muutoksella pyritään omaksumaan globaalimpi lähestymistapa kiinnostavien ehdokasgeenien tunnistamiseen suorittamalla Affymetrix SNP -analyysi näytteille, jotka on otettu osallistujilta, jotka olivat noudattaneet runsaasti glukorafaniinia sisältävää ruokavaliota.

Siksi kunkin osallistujan GSTM1-genotyyppi ja muut toistaiseksi tunnistamattomat ehdokasgeenit määritetään sen arvioimiseksi, vaikuttaako genotyyppi ITC:n erittymisnopeuteen virtsaan, joko yksinään tai yhdessä niiden fylogisen profiilin kanssa. Jokaiselta osallistujalta otetaan 5 ml:n verinäyte ja DNA uutetaan. Tämän jälkeen PCR:llä testataan, onko geeni läsnä vai ei.