Konverteringen av ENcapsulated GlucorAphanin, Gut Microbiota Phylogeny and gEnotype Study (ENGAGE) (ENGAGE)

Glukosinolater (GSL) är icke-flyktiga svavelhaltiga fytokemikalier (sekundära metaboliter) som finns i växtvävnader från korsblommiga grödor, såsom broccoli, kål och vattenkrasse. Glukosinolater ackumuleras i dessa livsmedel med glucoraphanin som det dominerande glukosinolatet som finns i broccoli. När vävnaden störs omvandlas glukosinolaterna till isotiocyanater (ITC) av enzymet myrosinas. Sulforafan är den dominerande ITC som erhålls genom enzymatisk hydrolys från glukorafanin. När grönsaker tillagas mycket noggrant denatureras myrosinasenzymet vilket resulterar i att GSL passerar genom mag-tarmkanalen (GI) in i tjocktarmen.

ITC har i djurstudier visat sig ha olika biologiska effekter, såsom antioxidanteffekter; antiinflammatoriska egenskaper; hämning av trombocytaggregation; minskning av systoliskt blodtryck och minskning av kolesterolnivåer; som alla minskar risken för att utveckla hjärt- och kärlsjukdomar. Sulforaphane har kopplats till hälsofördelar hos människor, såsom cancerkemoprevention och hjälper till att upprätthålla ett friskt hjärta.

När kokta korsblommiga grönsaker, där myrosinasenzymet har inaktiverats, konsumeras producerar en del av mikrofloran i tjocktarmen ett myrosinasliknande enzym som också kan omvandla glukosinolater till ITC. Denna process av tarmmikrobiota omvandling av glukorafanin till ITC avskaffas genom enteriska antibiotika och tarmrengöring. Det har gjorts flera in vitro-studier med både rena och blandade kulturer av bakterier som bekräftar förmågan hos bakteriestammar som finns i den mänskliga tarmen och som har förmågan att metabolisera GSL i kultur. Det har visat sig att omfattningen av omvandling av GSL till ITC av mänsklig tarmmikrobiota varierar mycket mellan individer men omvandlingshastigheten från upprepade bestämningar inom individer är mycket mer konsekventa. En nyligen genomförd studie försökte korrelera omvandlingen av glukosinolat ex vivo av mänskliga tarmbakterier till in vivo-data om glukosinolatmetabolism från ett litet antal individer, men ingen specifik koppling till individuella bakteriespecialiteter fastställdes.

Vår studie är en mänsklig kostintervention där deltagarna kommer att konsumera en kapsel innehållande 100 mg renat glukorafanin från broccoli. Nivåerna av glukorafanin som levereras av kapseln liknar en till två portioner broccoli. Eftersom detta är renat glukorafanin finns inget myrosinasenzym närvarande. All omvandling av glukorafanin, som finns i kapseln, till ITC kommer därför att ske av enzymer som finns i tarmmikrobiotan.

Förmågan hos glukorafanin i kapseln att metaboliseras till ITC av tarmmikrofloran är okänd och kommer att bedömas genom att mäta ITC som utsöndras i urinen. I korthet kommer varje deltagare i studien att uppmanas att avstå från mat som innehåller glukosinolat och ITC i tre dagar före dietintervention och i ytterligare 24 timmar under interventionen. De kommer att uppmanas att fasta över natten innan studiedagsinterventionen och på morgonen efter fastan ta ett urinprov. Detta kommer i praktiken att utgöra ett negativt kontrollprov och användas som ett mått på överensstämmelse med dietrestriktionen. Deltagaren kommer sedan att få glucoraphanin-kapseln tillsammans med sin frukost. Kostrestriktionen kommer att fortsätta i ytterligare 24 timmar, under vilken tid deltagaren samlar upp all urin de producerar. ITC:erna kommer att kvantifieras i urin med HP-LC och LC-MS med hjälp av validerade analysmetoder. När 24-timmarsurinsamlingen är klar kommer dietrestriktionerna att upphöra.

Det har visats i humana kostinterventionsstudier att graden av omvandling av glukosinolater varierar mycket. För att bedöma möjliga orsaksfaktorer för variation i hastigheten av glukorafaninmetabolism kommer varje deltagare att tillhandahålla ett fekalt prov från vilket deras avföringsmikrobiota-fylogeni kommer att analyseras. En detaljerad beskrivning av hur provet ska samlas in tillsammans med all nödvändig utrustning kommer att tillhandahållas. Avföringsproverna kommer att returneras till studieforskaren inom två timmar efter produktionen för att bibehålla avföringsbakteriernas livsduglighet.

För ett litet antal deltagare kommer ett andra avföringsprov att begäras (max 3 deltagare). Målet är att välja en låg, en medelhög och en hög ITC-utsöndring. Idealiskt skulle de låga och höga utsöndringarna vara inom de lägsta och högsta 5 % utsöndringen av ITC och den tredje deltagaren kommer att vara så nära den genomsnittliga ITC-utsöndringen som möjligt. Syftet är att odla den fekala mikrobiotan över tid med upprepad dosering av glukorafanin för att selektera för mikrobiota som kan metabolisera glukorafanin. Det är känt att den huvudsakliga hydrolysprodukten av glukorafanin, sulforafan, har en mängd fördelar för människors hälsa, men det finns ingen känd klinisk relevans för att vara en hög, medel eller låg utsöndrare av ITC.

Flera epidemiologiska studier och interventionsstudier tyder på att hälsofördelarna och det fysiologiska svaret på korsblommiga grönsaker kan förmedlas av en individs GSTM1-genotyp (glutation-S-transferaser (GST) genfamilj). När ITC absorberas i kroppen konjugerar de med glutation och metaboliseras sedan genom merkaptursyravägen. Konjugering sker spontant på grund av den relativt höga koncentrationen av glutation i celler jämfört med ITC-koncentrationen. Men eftersom icke-konjugerade ITC förekommer i plasma, måste det i något skede finnas dissociation av ITC-tiolkonjugatet. Man tror att detta kan katalyseras av GSTM1-enzymet. Ungefär 50 % av befolkningen har en homolog deletion av GSTM1-genen vilket resulterar i en noll genotyp, och 20 % har en deletion av GSTT1-genen. Det finns några studier, inklusive en av våra egna, som tyder på att genotypen GSTM1 kan påverka hastigheten för ITC-utsöndring i urin, men som inte har föreslagit att genotypen GSTM1 påverkar ITC-koncentrationen i plasma.

Opublicerade resultat från en tidigare intervention, Diet and Vascular Health-studien; Clinical Trials.gov: NCT01114399 har lagt tilltro till uppfattningen att GSTM1 null metaboliserar sulforafan på ett annat sätt än de med en funktionell GSTM1-allel. Tillsammans med GST-genfamiljen och deras associering med korsblommiga grönsaker kan det finnas andra gener av intresse som kan bestämma omfattningen av glukorafanin omvandling till sulforafan. Arbete som utförts på vår tidigare intervention, Diet and Vascular Health-studien har försökt undersöka möjliga kandidatgener. Med en betydande ändring som vill ta ett mer globalt tillvägagångssätt för att identifiera kandidatgener av intresse genom att utföra en Affymetrix SNP-analys på prover från deltagare som hade ätit en diet med hög glukorafanin.

Därför kommer GSTM1-genotypen och andra, ännu oidentifierade kandidatgener för varje deltagare, att bestämmas för att bedöma om genotypen påverkar hastigheten för ITC-utsöndring i urin, antingen ensamt eller i kombination med deras fylogena profil. Ett 5 ml blodprov kommer att tas från varje deltagare och DNA extraheras, PCR kommer sedan att användas för att testa om genen finns eller inte.