La conversione di GlucorAphanin incapsulato, la filogenesi del microbiota intestinale e lo studio del genetipo (ENGAGE) (ENGAGE)

I glucosinolati (GSL) sono sostanze fitochimiche contenenti zolfo non volatili (metaboliti secondari) che si trovano nei tessuti delle piante delle crocifere, come broccoli, cavoli e crescione. I glucosinolati si accumulano in questi alimenti con la glucorafanina che è il glucosinolato predominante presente nei broccoli. Quando il tessuto viene distrutto, i glucosinolati vengono convertiti in isotiocianati (ITC) dall'enzima mirosinasi. Il sulforafano è l'ITC predominante ottenuto per idrolisi enzimatica dalla glucorafanina. Quando le verdure vengono cotte molto accuratamente, l'enzima mirosinasi viene denaturato, il che fa sì che i GSL passino attraverso il tratto gastrointestinale (GI) nel colon.

Gli ITC hanno dimostrato in studi sugli animali di esercitare diversi effetti biologici, come effetti antiossidanti; proprietà antinfiammatorie; inibizione dell'aggregazione piastrinica; riduzione della pressione arteriosa sistolica e riduzione dei livelli di colesterolo; tutto ciò riduce il rischio di sviluppare malattie cardiovascolari. Il sulforafano è stato collegato a benefici per la salute negli esseri umani, come la chemioprevenzione del cancro e l'aiuto a mantenere un cuore sano.

Quando vengono consumate verdure crocifere cotte, in cui l'enzima mirosinasi è stato inattivato, parte della microflora nel colon produce un enzima simile alla mirosinasi che può anche convertire i glucosinolati in ITC. Questo processo di conversione del microbiota intestinale della glucorafanina in ITC viene abolito dagli antibiotici enterici e dalla pulizia intestinale. Sono stati condotti diversi studi in vitro con colture di batteri sia pure che miste che confermano la capacità dei ceppi batterici trovati nell'intestino umano di metabolizzare i GSL in coltura. È stato dimostrato che l'entità della conversione di GSL in ITC da parte del microbiota intestinale umano varia notevolmente tra gli individui, ma il tasso di conversione da determinazioni ripetute all'interno degli individui è molto più coerente. Uno studio recente ha tentato di correlare la conversione del glucosinolato ex vivo da parte dei batteri intestinali umani ai dati in vivo del metabolismo del glucosinolato da un piccolo numero di individui, tuttavia non è stato stabilito alcun legame specifico con le singole specialità batteriche.

Il nostro studio è un intervento dietetico umano in cui i partecipanti consumeranno una capsula contenente 100 mg di glucorafanina purificata dai broccoli. I livelli di glucorafanina forniti dalla capsula sono simili a una o due porzioni di broccoli. Poiché si tratta di glucorafanina purificata, non è presente l'enzima mirosinasi. Tutta la conversione della glucorafanina, contenuta all'interno della capsula, in ITC avverrà quindi da enzimi presenti nel microbiota intestinale.

La capacità della glucorafanina nella capsula di essere metabolizzata in ITC dalla microflora intestinale non è nota e sarà valutata misurando gli ITC escreti nelle urine. In breve, a ciascun partecipante allo studio verrà richiesto di astenersi da qualsiasi alimento contenente glucosinolati e ITC per tre giorni prima dell'intervento dietetico e per ulteriori 24 ore durante l'intervento. Verrà loro richiesto di digiunare durante la notte prima dell'intervento del giorno di studio e la mattina dopo il digiuno raccogliere un campione di urina. Questo costituirà effettivamente un campione di controllo negativo e sarà utilizzato come misura del rispetto della restrizione dietetica. Al partecipante verrà quindi data la capsula di glucorafanina insieme alla colazione. La restrizione dietetica continuerà per altre 24 ore, durante le quali il partecipante raccoglierà tutta l'urina che produce. Gli ITC saranno quantificati nelle urine mediante HP-LC e LC-MS utilizzando metodi analitici validati. Una volta completata la raccolta delle urine delle 24 ore, la restrizione dietetica cesserà.

È stato dimostrato in studi di intervento dietetico umano che l'entità della conversione dei glucosinolati varia notevolmente. Al fine di valutare possibili fattori causali per la variazione del tasso di metabolismo della glucorafanina, ciascun partecipante fornirà un campione fecale da cui verrà analizzata la filogenesi del microbiota intestinale fecale. Verrà fornita una descrizione dettagliata di come raccogliere il campione insieme a tutta l'attrezzatura necessaria. I campioni fecali verranno restituiti allo scienziato dello studio entro due ore dalla produzione al fine di mantenere la vitalità dei batteri fecali.

Per un piccolo numero di partecipanti sarà richiesto un secondo campione fecale (massimo 3 partecipanti). L'obiettivo è quello di selezionare un escretore di ITC basso, uno medio e uno alto. Idealmente gli escretori bassi e alti sarebbero compresi tra l'escrezione minima e massima del 5% di ITC e il terzo partecipante sarà il più vicino possibile all'escrezione media di ITC. L'obiettivo è quello di coltivare il microbiota fecale nel tempo con dosi ripetute di glucorafanina al fine di selezionare il microbiota in grado di metabolizzare la glucorafanina. È noto che il principale prodotto di idrolisi della glucorafanina, il sulforafano, ha una varietà di benefici per la salute umana, tuttavia non è nota alcuna rilevanza clinica per essere un escretore alto, medio o basso di ITC.

Diversi studi epidemiologici e di intervento suggeriscono che i benefici per la salute e la risposta fisiologica alle verdure crocifere possono essere mediati dal genotipo GSTM1 di un individuo (famiglia di geni glutatione-S-transferasi (GST)). Quando gli ITC vengono assorbiti nel corpo, si coniugano con il glutatione e vengono quindi metabolizzati attraverso la via dell'acido mercapturico. La coniugazione avviene spontaneamente a causa della concentrazione relativamente alta di glutatione all'interno delle cellule rispetto alla concentrazione di ITC. Tuttavia, poiché nel plasma si verificano ITC non coniugati, a un certo punto deve verificarsi una dissociazione del coniugato ITC-tiolo. Si pensa che questo possa essere catalizzato dall'enzima GSTM1. Circa il 50% della popolazione ha una delezione omologa del gene GSTM1 risultante in un genotipo nullo e il 20% ha una delezione del gene GSTT1. Ci sono alcuni studi, incluso uno dei nostri, che suggeriscono che il genotipo GSTM1 può influenzare il tasso di escrezione di ITC nelle urine, ma non hanno suggerito che il genotipo GSTM1 influenzi la concentrazione plasmatica massima di ITC.

Risultati non pubblicati di un precedente intervento, lo studio Diet and Vascular Health; Sperimentazioni cliniche.gov: NCT01114399 hanno aggiunto credibilità all'idea che GSTM1 annulli il metabolismo del sulforafano in modo diverso rispetto a quelli con un allele GSTM1 funzionale. Insieme alla famiglia del gene GST e alla loro associazione con le verdure crocifere, potrebbero esserci altri geni di interesse che potrebbero essere in grado di determinare l'entità della conversione della glucorafanina in sulforafano. Il lavoro svolto sul nostro precedente intervento, lo studio Diet and Vascular Health, ha cercato di indagare su possibili geni candidati. Con un emendamento sostanziale che cerca di adottare un approccio più globale nell'identificazione dei geni candidati di interesse eseguendo un'analisi Affymetrix SNP su campioni di partecipanti che avevano seguito una dieta ricca di glucorafanina.

Pertanto, il genotipo GSTM1 e altri geni candidati non ancora identificati di ciascun partecipante saranno determinati per valutare se il genotipo influenza il tasso di escrezione di ITC nelle urine, da solo o in combinazione con il loro profilo filogenico. Verrà prelevato un campione di sangue da 5 ml da ciascun partecipante e il DNA estratto, verrà quindi utilizzata la PCR per verificare se il gene è presente o meno.