A kapszulázott glükokoraphanin átalakítása, a bélmikrobióta filogenetikai és gEnotípus-vizsgálata (ENGAGE) (ENGAGE)

A glükozinolátok (GSL) nem illékony, kéntartalmú fitokemikáliák (másodlagos metabolitok), amelyek a keresztesvirágú növények, például a brokkoli, a káposzta és a vízitorma növényi szöveteiben találhatók. A glükozinolátok felhalmozódnak ezekben az élelmiszerekben, a glükorafanin pedig a brokkoliban található domináns glükozinolát. Amikor a szövet felbomlik, a glükozinolátok a mirozináz enzim hatására izotiocianátokká (ITC-k) alakulnak át. A szulforafán a domináns ITC, amelyet a glükorafaninból enzimatikus hidrolízissel nyernek. Amikor a zöldségeket nagyon alaposan megfőzik, a mirozináz enzim denaturálódik, ami azt eredményezi, hogy a GSL-ek a gasztrointesztinális traktuson (GI) keresztül a vastagbélbe jutnak.

Állatkísérletek során kimutatták, hogy az ITC-k különféle biológiai hatásokat fejtenek ki, például antioxidáns hatást; gyulladásgátló tulajdonságok; a vérlemezke-aggregáció gátlása; a szisztolés vérnyomás csökkentése és a koleszterinszint csökkentése; amelyek mindegyike csökkenti a szív- és érrendszeri betegségek kialakulásának kockázatát. A szulforafánt összefüggésbe hozták az emberi egészségre gyakorolt ​​jótékony hatásokkal, például a rák kemoprevenciójával és az egészséges szív megőrzésében.

Amikor főtt keresztes virágú zöldségeket fogyasztanak, amelyekben a mirozináz enzimet inaktiválták, a vastagbél mikroflórájának egy része mirozináz-szerű enzimet termel, amely szintén képes a glükozinolátokat ITC-kké alakítani. A bélben oldódó antibiotikumok és a béltisztítás megszünteti a glükorafanin ITC-vé történő bélmikrobiótájának ezt a folyamatát. Számos in vitro vizsgálatot végeztek mind a tiszta, mind a kevert baktériumkultúrákkal, amelyek megerősítették az emberi bélben található baktériumtörzsek azon képességét, hogy a tenyészetben GSL-eket metabolizáljanak. Kimutatták, hogy az emberi bélmikrobióta által a GSL-ek ITC-vé való átalakulásának mértéke egyedenként nagymértékben változik, de az egyéneken belüli ismételt meghatározásokból származó konverziós arány sokkal konzisztensebb. Egy közelmúltban végzett tanulmány megkísérelte korrelálni a glükozinolát ex vivo humán bélbaktériumok általi átalakulását a glükozinolát metabolizmusának in vivo adataival, amelyek kisszámú egyedből származtak, azonban nem állapítottak meg konkrét kapcsolatot az egyes baktériumok különlegességeivel.

Vizsgálatunk egy humán diétás beavatkozás, amelyben a résztvevők egy kapszulát fogyasztanak el, amely 100 mg tisztított brokkoli glükorafanint tartalmaz. A kapszula által szállított glükorafanin szintje hasonló egy-két adag brokkolihoz. Mivel ez tisztított glükorafanin, nincs jelen mirozináz enzim. A kapszulában található glükorafanin ITC-vé történő átalakulása tehát a bélmikrobiótában található enzimek által történik.

A kapszulában lévő glükorafanin azon képessége, hogy a bél mikroflórája ITC-kké metabolizálódjon, nem ismert, és a vizelettel kiválasztott ITC-k mérésével fogják értékelni. Röviden összefoglalva, a vizsgálatban részt vevő minden résztvevőnek tartózkodnia kell minden glükozinolátot és ITC-t tartalmazó élelmiszertől a diétás beavatkozás előtt három napig, és a beavatkozás alatt további 24 óráig. Arra kérik őket, hogy a vizsgálati napi beavatkozás előtt egy éjszakán át koplaljanak, és a koplalás utáni reggelen vegyenek vizeletmintát. Ez hatékonyan negatív kontrollmintát képez, és az étrendi korlátozás betartásának mérésére szolgál. A résztvevő ezután megkapja a glükorafanin kapszulát a reggelivel együtt. Az étkezési korlátozás további 24 órán keresztül folytatódik, ezalatt a résztvevő összeszedi az általa termelt vizeletet. Az ITC-k mennyiségét a vizeletben HP-LC-vel és LC-MS-sel, validált analitikai módszerekkel határozzák meg. Amint a 24 órás vizeletgyűjtés befejeződött, az étrendi korlátozás megszűnik.

Humán étrendi intervenciós vizsgálatok kimutatták, hogy a glükozinolátok átalakulásának mértéke nagyon változó. A glükorafanin metabolizmus sebességének változását kiváltó lehetséges okok felmérése érdekében minden résztvevő székletmintát ad, amelyből a székletbél mikrobiota törzsfejlődését elemzik. Részletes leírást adnak a mintavétel módjáról, valamint az összes szükséges felszerelést. A székletmintákat az előállítást követő két órán belül visszajuttatják a kutatónak a székletbaktériumok életképességének megőrzése érdekében.

Kis számú résztvevő esetén egy második székletmintát is kérnek (maximum 3 résztvevő). A cél egy alacsony, egy közepes és egy magas ITC-kiválasztó kiválasztása. Ideális esetben az alacsony és a magas ürítők a legalacsonyabb és legmagasabb 5%-os ITC-ürítésen belül vannak, a harmadik résztvevő pedig a lehető legközelebb van az átlagos ITC-kiválasztáshoz. A cél a széklet mikrobiota idővel történő tenyésztése a glükorafanin ismételt adagolásával annak érdekében, hogy kiválasszák azokat a mikrobiotákat, amelyek képesek a glükorafanint metabolizálni. Ismeretes, hogy a glükorafanin fő hidrolízisterméke, a szulforafán számos előnnyel jár az emberi egészségre nézve, azonban nincs ismert klinikai jelentősége annak, hogy magas, közepes vagy alacsony ITC-kiválasztó.

Számos epidemiológiai és intervenciós tanulmány utal arra, hogy a keresztesvirágú zöldségekre adott egészségügyi előnyöket és fiziológiai választ az egyén GSTM1 genotípusa (glutation-S-transzferázok (GST) géncsaládja) közvetítheti. Amikor az ITC-k felszívódnak a szervezetben, glutationnal konjugálnak, majd a merkaptursav úton metabolizálódnak. A konjugáció spontán történik, mivel a glutation koncentrációja viszonylag magas a sejten belül az ITC-koncentrációhoz képest. Mivel azonban a nem konjugált ITC-k előfordulnak a plazmában, bizonyos szakaszban az ITC-tiol konjugátum disszociációjának kell lennie. Úgy gondolják, hogy ezt a GSTM1 enzim katalizálhatja. A populáció körülbelül 50%-ánál a GSTM1 gén homológ deléciója null genotípust eredményez, és 20%-ánál a GSTT1 gén deléciója. Vannak olyan tanulmányok, köztük egy sajátunk is, amelyek azt sugallják, hogy a GSTM1 genotípus befolyásolhatja az ITC vizelettel történő kiválasztódásának sebességét, de nem utaltak arra, hogy a GSTM1 genotípus befolyásolná a plazma ITC csúcskoncentrációját.

Egy korábbi beavatkozás, a Diet and Vascular Health tanulmány nem publikált eredményei; Clinical Trials.gov: Az NCT01114399 hitelt kölcsönöz annak az elképzelésnek, hogy a GSTM1 nullák más módon metabolizálják a szulforafánt, mint a funkcionális GSTM1 alléllal rendelkezők. A GST géncsaládon és a keresztesvirágú zöldségekkel való kapcsolatukon kívül más érdekes gének is lehetnek, amelyek képesek meghatározni a glükorafanin szulforafánná való átalakulásának mértékét. A korábbi beavatkozásunkon, a Diet and Vascular Health tanulmányon végzett munka a lehetséges jelölt géneket kívánta megvizsgálni. Lényeges módosítással, amely globálisabb megközelítést kíván alkalmazni az érdeklődésre számot tartó gének azonosítására oly módon, hogy Affymetrix SNP-analízist végeznek olyan résztvevők mintáin, akik magas glükorafanintartalmú diétán voltak.

Ezért minden résztvevőnél meghatározzák a GSTM1 genotípust és más, egyelőre nem azonosított jelölt géneket, hogy felmérjék, hogy a genotípus befolyásolja-e az ITC vizeletben történő kiválasztódásának sebességét, akár önmagában, akár filogén profiljukkal kombinálva. Minden résztvevőtől 5 ml-es vérmintát vesznek, és a DNS-t kivonják, majd PCR-t használnak annak tesztelésére, hogy a gén jelen van-e vagy sem.