Die Umwandlung von ENcapsulated GlucorAphanin, Darm Microbiota Phylogeny and gEnotype Study (ENGAGE) (ENGAGE)

Glucosinolate (GSLs) sind nichtflüchtige schwefelhaltige sekundäre Pflanzenstoffe (sekundäre Metaboliten), die in Pflanzengeweben von Kreuzblütlern wie Brokkoli, Kohl und Brunnenkresse vorkommen. Glucosinolate reichern sich in diesen Lebensmitteln an, wobei Glucoraphanin das vorherrschende Glucosinolat in Brokkoli ist. Wenn Gewebe zerstört wird, werden die Glucosinolate durch das Enzym Myrosinase in Isothiocyanate (ITCs) umgewandelt. Sulforaphan ist das vorherrschende ITC, das durch enzymatische Hydrolyse aus Glucoraphanin gewonnen wird. Wenn Gemüse sehr gründlich gekocht wird, wird das Myrosinase-Enzym denaturiert, was dazu führt, dass GSLs durch den Gastrointestinaltrakt (GI) in den Dickdarm gelangen.

In Tierstudien wurde gezeigt, dass die ITCs verschiedene biologische Wirkungen ausüben, wie z. B. antioxidative Wirkungen; entzündungshemmende Eigenschaften; Hemmung der Blutplättchenaggregation; Senkung des systolischen Blutdrucks und Senkung des Cholesterinspiegels; All dies verringert das Risiko, Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu entwickeln. Sulforaphan wurde mit gesundheitlichen Vorteilen beim Menschen in Verbindung gebracht, wie z. B. Chemoprävention gegen Krebs und zur Erhaltung eines gesunden Herzens.

Wenn gekochtes Kreuzblütlergemüse verzehrt wird, in dem das Myrosinase-Enzym inaktiviert wurde, produziert ein Teil der Mikroflora im Dickdarm ein Myrosinase-ähnliches Enzym, das auch Glucosinolate in ITCs umwandeln kann. Dieser Prozess der Darmmikrobiota-Umwandlung von Glucoraphanin in ITC wird durch enterische Antibiotika und Darmreinigung aufgehoben. Es wurden mehrere In-vitro-Studien durchgeführt, die sowohl mit reinen als auch mit gemischten Bakterienkulturen durchgeführt wurden, die die Fähigkeit von im menschlichen Darm gefundenen Bakterienstämmen bestätigten, GSLs in Kultur zu metabolisieren. Es hat sich gezeigt, dass das Ausmaß der Umwandlung von GSLs in ITCs durch die menschliche Darmmikrobiota stark zwischen Individuen variiert, aber die Umwandlungsrate aus wiederholten Bestimmungen innerhalb von Individuen viel konsistenter ist. In einer kürzlich durchgeführten Studie wurde versucht, die Umwandlung von Glucosinolat ex vivo durch menschliche Darmbakterien mit in vivo-Daten des Glucosinolatstoffwechsels einer kleinen Anzahl von Personen zu korrelieren, es wurde jedoch keine spezifische Verbindung zu individuellen bakteriellen Besonderheiten hergestellt.

Unsere Studie ist eine Ernährungsintervention am Menschen, bei der die Teilnehmer eine Kapsel mit 100 mg gereinigtem Glucoraphanin aus Brokkoli konsumieren. Die von der Kapsel abgegebenen Mengen an Glucoraphanin ähneln denen von ein bis zwei Portionen Brokkoli. Da es sich um gereinigtes Glucoraphanin handelt, ist kein Myrosinase-Enzym vorhanden. Die gesamte Umwandlung des in der Kapsel enthaltenen Glucoraphanins in ITC erfolgt daher durch Enzyme, die in der Darmmikrobiota vorkommen.

Die Fähigkeit des Glucoraphanins in der Kapsel, durch die Darmflora zu ITCs metabolisiert zu werden, ist unbekannt und wird durch Messung der im Urin ausgeschiedenen ITCs bestimmt. Kurz gesagt wird jeder Teilnehmer an der Studie aufgefordert, drei Tage vor der diätetischen Intervention und für weitere 24 Stunden während der Intervention auf Glucosinolat- und ITC-haltige Lebensmittel zu verzichten. Sie werden gebeten, vor dem Eingriff am Studientag über Nacht zu fasten und am Morgen nach dem Fasten eine Urinprobe zu sammeln. Dies stellt effektiv eine negative Kontrollprobe dar und wird als Maß für die Einhaltung der diätetischen Beschränkung verwendet. Der Teilnehmer erhält dann die Glucoraphanin-Kapsel zusammen mit seinem Frühstück. Die diätetische Einschränkung wird für weitere 24 Stunden fortgesetzt, während dieser Zeit sammelt der Teilnehmer den gesamten Urin, den er produziert. Die ITCs werden im Urin durch HP-LC und LC-MS mit validierten Analysemethoden quantifiziert. Sobald die 24-Stunden-Urinsammlung abgeschlossen ist, endet die diätetische Einschränkung.

In Ernährungsinterventionsstudien beim Menschen wurde gezeigt, dass das Ausmaß der Umwandlung von Glucosinolaten stark variiert. Um mögliche ursächliche Faktoren für Schwankungen in der Rate des Glucoraphanin-Stoffwechsels zu bewerten, stellt jeder Teilnehmer eine Kotprobe zur Verfügung, aus der die Phylogenie seiner fäkalen Darmmikrobiota analysiert wird. Eine detaillierte Beschreibung, wie die Probe gesammelt werden sollte, zusammen mit allen erforderlichen Geräten wird zur Verfügung gestellt. Die Kotproben werden innerhalb von zwei Stunden nach der Produktion an den Studienwissenschaftler zurückgeschickt, um die Lebensfähigkeit der Kotbakterien zu erhalten.

Bei einer geringen Teilnehmerzahl wird eine zweite Kotprobe angefordert (maximal 3 Teilnehmer). Ziel ist es, einen niedrigen, einen mittleren und einen hohen ITC-Ausscheider auszuwählen. Idealerweise liegen die niedrigen und hohen Ausscheider innerhalb der niedrigsten und höchsten 5 %-Ausscheidung von ITC, und der dritte Teilnehmer liegt so nah wie möglich an der mittleren ITC-Ausscheidung. Ziel ist es, die fäkale Mikrobiota über einen längeren Zeitraum mit wiederholter Gabe von Glucoraphanin zu kultivieren, um auf Mikrobiota zu selektieren, die in der Lage sind, Glucoraphanin zu metabolisieren. Es ist bekannt, dass das Haupthydrolyseprodukt von Glucoraphanin, Sulforaphan, eine Reihe von Vorteilen für die menschliche Gesundheit hat, es ist jedoch keine klinische Relevanz dafür bekannt, dass es ein hoher, mittlerer oder niedriger ITC-Ausscheider ist.

Mehrere epidemiologische und Interventionsstudien deuten darauf hin, dass die gesundheitlichen Vorteile und die physiologische Reaktion auf Kreuzblütler durch den GSTM1-Genotyp (Genfamilie der Glutathion-S-Transferasen (GST)) einer Person vermittelt werden können. Wenn ITCs in den Körper aufgenommen werden, konjugieren sie mit Glutathion und werden dann über den Mercaptursäureweg metabolisiert. Die Konjugation erfolgt spontan aufgrund der relativ hohen Konzentration von Glutathion in den Zellen im Vergleich zur ITC-Konzentration. Da jedoch nicht-konjugierte ITCs im Plasma vorkommen, muss es irgendwann zu einer Dissoziation des ITC-Thiol-Konjugats kommen. Es wird angenommen, dass dies durch das GSTM1-Enzym katalysiert wird. Ungefähr 50 % der Bevölkerung haben eine homologe Deletion des GSTM1-Gens, die zu einem Null-Genotyp führt, und 20 % haben eine Deletion des GSTT1-Gens. Es gibt einige Studien, einschließlich einer unserer eigenen, die darauf hindeuten, dass der GSTM1-Genotyp die Rate der ITC-Ausscheidung im Urin beeinflussen kann, aber nicht darauf hindeutet, dass der GSTM1-Genotyp die ITC-Spitzenkonzentration im Plasma beeinflusst.

Unveröffentlichte Ergebnisse einer früheren Intervention, der Studie Diet and Vascular Health; Klinische Studien.gov: NCT01114399 haben der Vorstellung Glaubwürdigkeit verliehen, dass GSTM1-Nullen Sulforaphan anders metabolisieren als solche mit einem funktionellen GSTM1-Allel. Zusammen mit der GST-Genfamilie und ihrer Assoziation mit Kreuzblütlern gibt es möglicherweise andere Gene von Interesse, die möglicherweise das Ausmaß der Umwandlung von Glucoraphanin in Sulforaphan bestimmen können. Die Arbeit an unserer früheren Intervention, der Studie Diet and Vascular Health, hat versucht, mögliche Kandidatengene zu untersuchen. Mit einer wesentlichen Änderung, die darauf abzielt, einen globaleren Ansatz bei der Identifizierung von interessierenden Kandidatengenen zu verfolgen, indem eine Affymetrix-SNP-Analyse an Proben von Teilnehmern durchgeführt wird, die eine glucoraphaninreiche Diät eingenommen haben.

Daher werden der GSTM1-Genotyp und andere, noch nicht identifizierte Kandidatengene jedes Teilnehmers bestimmt, um zu beurteilen, ob der Genotyp die Rate der ITC-Ausscheidung im Urin beeinflusst, entweder allein oder in Kombination mit ihrem phylogenetischen Profil. Jedem Teilnehmer wird eine 5-ml-Blutprobe entnommen und die DNA extrahiert. Anschließend wird mittels PCR getestet, ob das Gen vorhanden ist oder nicht.