Konwersja kapsułek GlucorAphanin, badanie filogenezy mikroflory jelitowej i genotypu (ENGAGE) (ENGAGE)

Glukozynolany (GSL) to nielotne związki fitochemiczne zawierające siarkę (metabolity wtórne) występujące w tkankach roślin roślin krzyżowych, takich jak brokuły, kapusta i rzeżucha. Glukozynolany gromadzą się w tych pokarmach, przy czym glukorafanina jest dominującym glukozynolanem występującym w brokułach. Kiedy tkanka jest rozerwana, glukozynolany są przekształcane w izotiocyjaniany (ITC) przez enzym mirozynazę. Sulforafan jest dominującym ITC otrzymywanym w drodze enzymatycznej hydrolizy z glukorafaniny. Kiedy warzywa są bardzo dokładnie ugotowane, enzym mirozynaza ulega denaturacji, co powoduje, że GSL przechodzą przez przewód pokarmowy (GI) do okrężnicy.

W badaniach na zwierzętach wykazano, że ITC wywierają różnorodne efekty biologiczne, takie jak działanie przeciwutleniające; właściwości przeciwzapalne; hamowanie agregacji płytek krwi; obniżenie skurczowego ciśnienia krwi i obniżenie poziomu cholesterolu; z których wszystkie zmniejszają ryzyko rozwoju chorób sercowo-naczyniowych. Sulforafan został powiązany z korzyściami zdrowotnymi u ludzi, takimi jak chemoprewencja raka i pomoc w utrzymaniu zdrowego serca.

Kiedy spożywa się gotowane warzywa krzyżowe, w których enzym mirozynaza został inaktywowany, część mikroflory w okrężnicy wytwarza enzym podobny do mirozynazy, który może również przekształcać glukozynolany w ITC. Ten proces przekształcania glukorafaniny w ITC przez mikroflorę jelitową jest znoszony przez antybiotyki dojelitowe i oczyszczanie jelit. Przeprowadzono kilka badań in vitro zarówno z czystymi, jak i mieszanymi kulturami bakterii, które potwierdziły zdolność szczepów bakteryjnych występujących w jelicie człowieka do metabolizowania GSL w hodowli. Wykazano, że stopień konwersji GSL do ITC przez ludzką mikroflorę jelitową różni się znacznie u poszczególnych osób, ale współczynnik konwersji z powtarzanych oznaczeń u poszczególnych osób jest znacznie bardziej spójny. W niedawnym badaniu podjęto próbę skorelowania konwersji glukozynolanów ex vivo przez ludzkie bakterie jelitowe z danymi in vivo dotyczącymi metabolizmu glukozynolanów u niewielkiej liczby osobników, jednak nie ustalono żadnego konkretnego związku z poszczególnymi specjałami bakteryjnymi.

Nasze badanie jest interwencją dietetyczną u ludzi, w której uczestnicy spożywają jedną kapsułkę zawierającą 100 mg oczyszczonej glukorafaniny z brokułów. Poziomy glukorafaniny dostarczane przez kapsułkę są podobne do jednej do dwóch porcji brokułów. Ponieważ jest to oczyszczona glukorafanina, nie zawiera enzymu mirozynazy. Wszelka konwersja glukorafaniny zawartej w kapsułce do ITC będzie zatem zachodzić przez enzymy znajdujące się w mikroflorze jelitowej.

Zdolność glukorafaniny zawartej w kapsułce do metabolizowania do ITC przez mikroflorę jelitową jest nieznana i będzie oceniana poprzez pomiar ilości ITC wydalanych z moczem. W skrócie, każdy uczestnik badania zostanie poproszony o powstrzymanie się od wszelkich pokarmów zawierających glukozynolany i ITC przez trzy dni przed interwencją dietetyczną i przez kolejne 24 godziny podczas interwencji. Zostaną poproszeni o poszczenie przez noc przed interwencją w dniu badania i rano po poście, aby pobrać próbkę moczu. Będzie to skutecznie stanowić negatywną próbkę kontrolną i będzie stosowane jako miara przestrzegania ograniczeń dietetycznych. Następnie uczestnik otrzyma kapsułkę z glukorafaniną wraz ze śniadaniem. Ograniczenia dietetyczne będą kontynuowane przez kolejne 24 godziny, podczas których uczestnik będzie zbierał cały produkowany przez siebie mocz. ITC zostaną oznaczone ilościowo w moczu za pomocą HP-LC i LC-MS przy użyciu zwalidowanych metod analitycznych. Po zakończeniu 24-godzinnej zbiórki moczu ograniczenie dietetyczne ustanie.

W badaniach nad interwencjami żywieniowymi u ludzi wykazano, że stopień przemiany glukozynolanów jest bardzo zróżnicowany. W celu oceny możliwych czynników sprawczych zmiany tempa metabolizmu glukorafaniny każdy uczestnik dostarczy próbkę kału, z której zostanie przeanalizowana filogeneza mikroflory jelitowej. Zostanie dostarczony szczegółowy opis sposobu pobrania próbki wraz z niezbędnym wyposażeniem. Próbki kału zostaną zwrócone naukowcowi prowadzącemu badanie w ciągu dwóch godzin od ich wyprodukowania w celu utrzymania żywotności bakterii kałowych.

W przypadku niewielkiej liczby uczestników wymagana będzie druga próbka kału (maksymalnie 3 uczestników). Celem jest wybranie jednego wydalacza o niskim, jednym średnim i jednym wysokim ITC. Idealnie, osoby o niskim i wysokim wydalaniu mieściłyby się w granicach 5% najniższego i najwyższego wydalania ITC, a trzeci uczestnik będzie jak najbardziej zbliżony do średniego wydalania ITC. Celem jest hodowla mikroflory kałowej w czasie z powtarzanym dawkowaniem glukorafaniny w celu wyselekcjonowania mikroflory zdolnej do metabolizowania glukorafaniny. Wiadomo, że główny produkt hydrolizy glukorafaniny, sulforafan, ma wiele korzyści dla zdrowia ludzkiego, jednak nie jest znane znaczenie kliniczne tego, że jest on wydalany w wysokim, średnim lub niskim stopniu ITC.

Kilka badań epidemiologicznych i interwencyjnych sugeruje, że korzyści zdrowotne i reakcja fizjologiczna na warzywa krzyżowe mogą być zależne od genotypu GSTM1 danej osoby (rodzina genów S-transferazy glutationu (GST)). Kiedy ITC są wchłaniane do organizmu, sprzęgają się z glutationem, a następnie są metabolizowane przez szlak kwasu merkapturowego. Koniugacja zachodzi spontanicznie ze względu na stosunkowo wysokie stężenie glutationu w komórkach w porównaniu ze stężeniem ITC. Ponieważ jednak w osoczu występują niezwiązane ITC, na pewnym etapie musi nastąpić dysocjacja koniugatu ITC-tiol. Uważa się, że może to być katalizowane przez enzym GSTM1. Około 50% populacji ma homologiczną delecję genu GSTM1 skutkującą zerowym genotypem, a 20% ma delecję genu GSTT1. Istnieją pewne badania, w tym nasze własne, które sugerują, że genotyp GSTM1 może wpływać na szybkość wydalania ITC z moczem, ale nie sugerują, że genotyp GSTM1 wpływa na maksymalne stężenie ITC w osoczu.

Niepublikowane wyniki z poprzedniej interwencji, badania Diet and Vascular Health; Clinical Trials.gov: NCT01114399 dodały wiarygodności poglądowi, że null GSTM1 metabolizują sulforafan w inny sposób niż te z funkcjonalnym allelem GSTM1. Wraz z rodziną genów GST i ich powiązaniem z warzywami krzyżowymi mogą istnieć inne interesujące geny, które mogą być w stanie określić stopień konwersji glukorafaniny do sulforafanu. Prace przeprowadzone w ramach naszej poprzedniej interwencji, badania Diet and Vascular Health, miały na celu zbadanie potencjalnych genów kandydujących. Z istotną poprawką mającą na celu przyjęcie bardziej globalnego podejścia do identyfikacji genów kandydujących będących przedmiotem zainteresowania poprzez wykonanie analizy SNP Affymetrix na próbkach od uczestników, którzy byli na diecie bogatej w glukorafaninę.

Dlatego genotyp GSTM1 i inne, jak dotąd, niezidentyfikowane geny kandydujące każdego uczestnika zostaną określone, aby ocenić, czy genotyp wpływa na szybkość wydalania ITC z moczem, samodzielnie lub w połączeniu z ich profilem filogenetycznym. Od każdego uczestnika zostanie pobrana 5 ml próbka krwi i wyekstrahowane DNA, a następnie zostanie użyty PCR do sprawdzenia, czy gen jest obecny, czy nie.