Преобразование инкапсулированного глюкорафанина, исследование филогении кишечной микробиоты и генотипа (ENGAGE) (ENGAGE)

Глюкозинолаты (GSL) представляют собой нелетучие серосодержащие фитохимические вещества (вторичные метаболиты), обнаруженные в растительных тканях крестоцветных культур, таких как брокколи, белокочанная капуста и кресс-салат. Глюкозинолаты накапливаются в этих продуктах, при этом глюкорафанин является преобладающим глюкозинолатом, содержащимся в брокколи. Когда ткань разрушается, глюкозинолаты превращаются в изотиоцианаты (ИТЦ) под действием фермента мирозиназы. Сульфорафан является преобладающим ITC, полученным ферментативным гидролизом глюкорафанина. Когда овощи готовятся очень тщательно, фермент мирозиназа денатурируется, в результате чего GSL проходят через желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) в толстую кишку.

В исследованиях на животных было показано, что ITC оказывают различные биологические эффекты, такие как антиоксидантные эффекты; противовоспалительные свойства; ингибирование агрегации тромбоцитов; снижение систолического артериального давления и снижение уровня холестерина; все это снижает риск развития сердечно-сосудистых заболеваний. Сульфорафан был связан с пользой для здоровья человека, такой как химиопрофилактика рака и помощь в поддержании здоровья сердца.

При употреблении приготовленных овощей семейства крестоцветных, в которых фермент мирозиназа инактивирован, часть микрофлоры толстой кишки вырабатывает фермент, подобный мирозиназе, который также может превращать глюкозинолаты в ИТЦ. Этот процесс преобразования кишечной микробиотой глюкорафанина в ITC отменяется энтеросолюбильными антибиотиками и очищением кишечника. Было проведено несколько исследований in vitro как с чистыми, так и со смешанными культурами бактерий, подтверждающих способность бактериальных штаммов, обнаруженных в кишечнике человека, метаболизировать GSL в культуре. Было показано, что степень преобразования GSL в ITC микробиотой кишечника человека сильно различается у разных людей, но скорость преобразования при повторных определениях у людей гораздо более постоянна. В недавнем исследовании была предпринята попытка сопоставить преобразование глюкозинолата ex vivo кишечными бактериями человека с данными метаболизма глюкозинолата in vivo у небольшого числа людей, однако не было установлено конкретной связи с отдельными бактериальными особенностями.

Наше исследование представляет собой вмешательство в диету человека, в ходе которого участники будут потреблять одну капсулу, содержащую 100 мг очищенного глюкорафанина из брокколи. Уровни глюкорафанина, доставляемого капсулой, аналогичны одной-двум порциям брокколи. Поскольку это очищенный глюкорафанин, фермент мирозиназа отсутствует. Таким образом, все превращение глюкорафанина, содержащегося в капсуле, в ITC будет происходить с помощью ферментов, обнаруженных в микробиоте кишечника.

Способность глюкорафанина в капсуле метаболизироваться микрофлорой кишечника в ИТЦ неизвестна и будет оцениваться путем измерения ИТЦ, выделяемых с мочой. Вкратце, каждому участнику исследования будет предложено воздерживаться от любых продуктов, содержащих глюкозинолат и ITC, в течение трех дней до диетического вмешательства и еще в течение 24 часов во время вмешательства. Им будет предложено голодать в течение ночи перед вмешательством в день исследования, а утром после голодания собрать образец мочи. Это фактически представляет собой отрицательный контрольный образец и используется в качестве меры соблюдения диетического ограничения. Затем участнику вместе с завтраком дадут капсулу глюкорафанина. Диетическое ограничение будет продолжаться еще 24 часа, в течение которых участник соберет всю мочу, которую он производит. ITC будут количественно определены в моче с помощью ВЭЖХ и ЖХ-МС с использованием утвержденных аналитических методов. Как только 24-часовой сбор мочи будет завершен, диетические ограничения будут сняты.

В исследованиях диетических вмешательств на людях было показано, что степень превращения глюкозинолатов сильно различается. Чтобы оценить возможные причинные факторы изменения скорости метаболизма глюкорафанина, каждый участник предоставит образец фекалий, из которого будет проанализирована филогения их фекальной кишечной микробиоты. Будет предоставлено подробное описание того, как следует собирать пробу, а также все необходимое оборудование. Образцы фекалий будут возвращены исследователю в течение двух часов после получения, чтобы сохранить жизнеспособность фекальных бактерий.

Для небольшого числа участников будет запрошен второй образец фекалий (максимум 3 участника). Цель состоит в том, чтобы выбрать один низкий, один средний и один высокий экскретор ITC. В идеале низкий и высокий экскреторы должны находиться в пределах 5% выделения ITC, а третий участник должен быть как можно ближе к среднему уровню выделения ITC. Цель состоит в том, чтобы культивировать фекальную микробиоту с течением времени с повторным введением глюкорафанина, чтобы отобрать микробиоту, способную метаболизировать глюкорафанин. Известно, что основной продукт гидролиза глюкорафанина, сульфорафан, имеет ряд преимуществ для здоровья человека, однако нет данных о клинической значимости высокого, среднего или низкого выделения ITC.

Несколько эпидемиологических и интервенционных исследований показывают, что польза для здоровья и физиологическая реакция на овощи семейства крестоцветных могут быть опосредованы индивидуальным генотипом GSTM1 (семейство генов глутатион-S-трансфераз (GST)). Когда ITC всасываются в организм, они конъюгируют с глутатионом и затем метаболизируются через путь меркаптуровой кислоты. Конъюгация происходит спонтанно из-за относительно высокой концентрации глутатиона в клетках по сравнению с концентрацией ITC. Однако, поскольку неконъюгированные ИТЦ встречаются в плазме, на каком-то этапе должна произойти диссоциация конъюгата ИТЦ-тиол. Считается, что это может катализироваться ферментом GSTM1. Приблизительно 50% популяции имеют гомологичную делецию гена GSTM1, приводящую к нулевому генотипу, а 20% имеют делецию гена GSTT1. Есть несколько исследований, в том числе одно из наших, в которых предполагается, что генотип GSTM1 может влиять на скорость экскреции ITC с мочой, но не предполагается, что генотип GSTM1 влияет на пиковую концентрацию ITC в плазме.

Неопубликованные результаты предыдущего вмешательства, исследования «Здоровье диеты и сосудов»; Клинические испытания.gov: NCT01114399 подтвердили мнение о том, что нулевые гены GSTM1 метаболизируют сульфорафан иначе, чем таковые с функциональным аллелем GSTM1. Наряду с семейством генов GST и их связью с овощами семейства крестоцветных могут существовать и другие представляющие интерес гены, которые могут определять степень превращения глюкорафанина в сульфорафан. Работа, проведенная в рамках нашего предыдущего вмешательства, исследования диеты и здоровья сосудов, была направлена ​​на изучение возможных генов-кандидатов. С существенной поправкой, направленной на использование более глобального подхода к выявлению представляющих интерес генов-кандидатов путем проведения анализа SNP Affymetrix на образцах участников, которые находились на диете с высоким содержанием глюкорафанина.

Следовательно, генотип GSTM1 и другие, пока еще не идентифицированные гены-кандидаты каждого участника будут определены для оценки того, влияет ли генотип на скорость экскреции ITC с мочой либо отдельно, либо в сочетании с их филогенетическим профилем. У каждого участника будет взят образец крови объемом 5 мл и извлечена ДНК, затем будет использована ПЦР для проверки наличия гена или его отсутствия.