A Conversão de GlucorAfanina ENcapsulada, Estudo de Filogenia e Genótipo da Microbiota Intestinal (ENGAGE) (ENGAGE)

Glucosinolatos (GSLs) são fitoquímicos não voláteis contendo enxofre (metabólitos secundários) encontrados em tecidos vegetais de culturas crucíferas, como brócolis, repolho e agrião. Os glucosinolatos se acumulam nesses alimentos, sendo a glucorafanina o glucosinolato predominante encontrado nos brócolis. Quando o tecido é rompido, os glucosinolatos são convertidos em isotiocianatos (ITCs) pela enzima mirosinase. O sulforafano é o ITC predominante obtido por hidrólise enzimática da glucorafanina. Quando os vegetais são bem cozidos, a enzima mirosinase é desnaturada, o que resulta na passagem de GSLs pelo trato gastrointestinal (GI) para o cólon.

Os ITCs demonstraram em estudos com animais exercer diversos efeitos biológicos, como efeitos antioxidantes; propriedades anti-inflamatórias; inibição da agregação plaquetária; redução da pressão arterial sistólica e redução dos níveis de colesterol; todos os quais reduzem o risco de desenvolver doenças cardiovasculares. O sulforafano tem sido associado a benefícios para a saúde em humanos, como a quimioprevenção do câncer e ajudando a manter um coração saudável.

Quando vegetais crucíferos cozidos, nos quais a enzima mirosinase foi inativada, são consumidos, parte da microflora no cólon produz uma enzima semelhante à mirosinase que também pode converter glucosinolatos em ITCs. Este processo de conversão da microbiota intestinal de glucorafanina em ITC é abolido por antibióticos entéricos e limpeza intestinal. Houve vários estudos in vitro realizados com culturas puras e mistas de bactérias, confirmando a capacidade das cepas bacterianas encontradas no intestino humano de metabolizar GSLs em cultura. Foi demonstrado que a extensão da conversão de GSLs em ITCs pela microbiota intestinal humana varia muito entre os indivíduos, mas a taxa de conversão de determinações repetidas dentro dos indivíduos é muito mais consistente. Um estudo recente tentou correlacionar a conversão de glucosinolato ex vivo por bactérias intestinais humanas com dados in vivo do metabolismo de glucosinolato de um pequeno número de indivíduos, no entanto, nenhuma ligação específica com bactérias especiais individuais foi estabelecida.

Nosso estudo é uma intervenção dietética humana na qual os participantes consumirão uma cápsula contendo 100 mg de glucorafanina purificada de brócolis. Os níveis de glucorafanina fornecidos pela cápsula são semelhantes a uma a duas porções de brócolis. Como se trata de glucorafanina purificada, não há enzima mirosinase presente. Toda a conversão da glucorafanina, contida na cápsula, em ITC ocorrerá, portanto, por enzimas encontradas na microbiota intestinal.

A capacidade da glucorafanina na cápsula de ser metabolizada em ITCs pela microflora intestinal é desconhecida e será avaliada medindo os ITCs excretados na urina. Em resumo, cada participante do estudo será solicitado a se abster de qualquer alimento contendo glucosinolato e ITC por três dias antes da intervenção dietética e por mais 24 horas durante a intervenção. Eles serão solicitados a jejuar durante a noite antes da intervenção do dia do estudo e na manhã após o jejum coletar uma amostra de urina. Isso constituirá efetivamente uma amostra de controle negativo e será usado como uma medida de conformidade com a restrição alimentar. O participante receberá a cápsula de glucorafanina junto com o café da manhã. A restrição alimentar continuará por mais 24 horas, período durante o qual o participante coletará toda a urina que produzir. Os ITCs serão quantificados na urina por HP-LC e LC-MS utilizando métodos analíticos validados. Assim que a coleta de urina de 24 horas estiver concluída, a restrição alimentar cessará.

Foi demonstrado em estudos de intervenção dietética humana que a extensão da conversão de glucosinolatos varia muito. A fim de avaliar possíveis fatores causadores de variação na taxa de metabolismo da glucorafanina, cada participante fornecerá uma amostra fecal a partir da qual a filogenia da microbiota intestinal fecal será analisada. Uma descrição detalhada de como a amostra deve ser coletada junto com todo o equipamento necessário será fornecida. As amostras fecais serão devolvidas ao cientista do estudo dentro de duas horas após a produção, a fim de manter a viabilidade das bactérias fecais.

Para um número reduzido de participantes será solicitada uma segunda amostra fecal (máximo de 3 participantes). O objetivo é selecionar um excretador de ITC baixo, um médio e um alto. Idealmente, os excretadores baixo e alto estariam dentro dos 5% mais baixos e mais altos de excreção de ITC e o terceiro participante estaria o mais próximo possível da média de excreção de ITC. O objetivo é cultivar a microbiota fecal ao longo do tempo com dosagem repetida de glucorafanina, a fim de selecionar a microbiota capaz de metabolizar a glucorafanina. Sabe-se que o principal produto da hidrólise da glucorafanina, o sulforafano, tem uma variedade de benefícios para a saúde humana, porém não há relevância clínica conhecida por ser um excretador alto, médio ou baixo de ITC.

Vários estudos epidemiológicos e de intervenção sugerem que os benefícios para a saúde e a resposta fisiológica aos vegetais crucíferos podem ser mediados pelo genótipo GSTM1 de um indivíduo (família de genes glutationa-S-transferases (GST)). Quando os ITCs são absorvidos pelo corpo, eles se conjugam com a glutationa e são então metabolizados pela via do ácido mercaptúrico. A conjugação ocorre espontaneamente devido à concentração relativamente alta de glutationa dentro das células em comparação com a concentração de ITC. No entanto, como ITCs não conjugados ocorrem no plasma, em algum estágio deve haver dissociação do conjugado ITC-tiol. Acredita-se que isso possa ser catalisado pela enzima GSTM1. Aproximadamente 50% da população tem uma deleção homóloga do gene GSTM1 resultando em um genótipo nulo, e 20% tem uma deleção do gene GSTT1. Existem alguns estudos, incluindo um de nossa autoria, que sugerem que o genótipo GSTM1 pode afetar a taxa de excreção de ITC na urina, mas não sugerem que o genótipo GSTM1 afete o pico de concentração plasmática de ITC.

Resultados inéditos de uma intervenção anterior, o estudo Diet and Vascular Health; Clinical Trials.gov: NCT01114399 adicionaram credibilidade à noção de que nulos GSTM1 metabolizam o sulforafano de uma maneira diferente daqueles com um alelo GSTM1 funcional. Juntamente com a família de genes GST e sua associação com vegetais crucíferos, pode haver outros genes de interesse que possam determinar a extensão da conversão de glucorafanina em sulforafano. Trabalho realizado em nossa intervenção anterior, o estudo Diet and Vascular Health procurou investigar possíveis genes candidatos. Com uma emenda substancial, procurando adotar uma abordagem mais global na identificação de genes candidatos de interesse, realizando uma análise Affymetrix SNP em amostras de participantes que estavam em uma dieta rica em glucorafanina.

Portanto, o genótipo GSTM1 e outros genes candidatos ainda não identificados de cada participante serão determinados para avaliar se o genótipo afeta a taxa de excreção de ITC na urina, isoladamente ou em combinação com seu perfil filogenético. Uma amostra de sangue de 5 ml será coletada de cada participante e o DNA extraído, a PCR será usada para testar se o gene está presente ou não.