Studie konverze enkapsulovaného glukorafaninu, fylogeneze střevní mikrobioty a genotypu (ENGAGE) (ENGAGE)

Glukosinoláty (GSL) jsou netěkavé fytochemikálie obsahující síru (sekundární metabolity), které se nacházejí v rostlinných tkáních brukvovitých plodin, jako je brokolice, zelí a řeřicha. Glukosinoláty se v těchto potravinách hromadí, přičemž glukorafanin je převládajícím glukosinolátem nalezeným v brokolici. Když je tkáň narušena, glukosinoláty jsou přeměněny na isothiokyanáty (ITC) enzymem myrosinázou. Sulforafan je převládající ITC získaný enzymatickou hydrolýzou z glukorafaninu. Když se zelenina velmi důkladně vaří, enzym myrosináza je denaturován, což vede k tomu, že GSL procházejí gastrointestinálním (GI) traktem do tlustého střeva.

Ve studiích na zvířatech bylo prokázáno, že ITC mají různé biologické účinky, jako jsou antioxidační účinky; protizánětlivé vlastnosti; inhibice agregace krevních destiček; snížení systolického krevního tlaku a snížení hladiny cholesterolu; to vše snižuje riziko vzniku kardiovaskulárních onemocnění. Sulforafan je spojován se zdravotními přínosy u lidí, jako je chemoprevence rakoviny a pomáhá udržovat zdravé srdce.

Když se konzumuje vařená brukvovitá zelenina, ve které byl enzym myrosináza inaktivován, část mikroflóry v tlustém střevě produkuje enzym podobný myrosináze, který může také převádět glukosinoláty na ITC. Tento proces přeměny glukorafaninu na ITC střevní mikroflórou je zrušen enterálními antibiotiky a očistou střev. Bylo provedeno několik studií in vitro jak s čistými, tak se smíšenými kulturami bakterií, které potvrzují schopnost bakteriálních kmenů nalezených v lidském střevě, které mají schopnost metabolizovat GSL v kultuře. Ukázalo se, že rozsah konverze GSL na ITC lidskou střevní mikroflórou se mezi jednotlivci velmi liší, ale míra konverze z opakovaných stanovení u jednotlivců je mnohem konzistentnější. Nedávná studie se pokusila korelovat přeměnu glukosinolátů ex vivo lidskými střevními bakteriemi s údaji o metabolismu glukosinolátů in vivo od malého počtu jedinců, nebyla však stanovena žádná konkrétní vazba na jednotlivé bakteriální speciality.

Naše studie je lidským dietním zásahem, při kterém účastníci konzumují jednu kapsli obsahující 100 mg purifikovaného glukorafaninu z brokolice. Hladiny glukorafaninu dodávané kapslí jsou podobné jako u jedné až dvou porcí brokolice. Protože se jedná o purifikovaný glukorafanin, není přítomen žádný enzym myrosináza. Veškerá přeměna glukorafaninu obsaženého v tobolce na ITC se proto uskuteční enzymy nacházejícími se ve střevní mikrobiotě.

Schopnost glukorafaninu v tobolce metabolizovat na ITC střevní mikroflórou není známa a bude hodnocena měřením ITC vyloučených v moči. Stručně řečeno, každý účastník studie bude požádán, aby se zdržel jakýchkoli potravin obsahujících glukosinolát a ITC tři dny před dietní intervencí a dalších 24 hodin během intervence. Budou požádáni, aby se přes noc před intervencí v den studie postili a ráno po hladovění odebrali vzorek moči. To bude účinně představovat negativní kontrolní vzorek a bude použito jako měřítko souladu s dietním omezením. Účastník pak dostane tobolku glukorafaninu spolu se snídaní. Dietní omezení bude pokračovat dalších 24 hodin, během kterých bude účastník shromažďovat veškerou moč, kterou produkují. ITC budou kvantifikovány v moči pomocí HP-LC a LC-MS za použití validovaných analytických metod. Jakmile je 24hodinový sběr moči dokončen, dietní omezení skončí.

Ve studiích dietních intervencí u lidí bylo prokázáno, že rozsah přeměny glukosinolátů se velmi liší. Aby bylo možné posoudit možné příčinné faktory pro variaci v rychlosti metabolismu glukorafaninu, každý účastník poskytne vzorek stolice, ze kterého bude analyzována fylogeneze jejich fekální střevní mikroflóry. Bude poskytnut podrobný popis toho, jak by měl být vzorek odebrán, spolu s veškerým nezbytným vybavením. Vzorky stolice budou vráceny vědci studie do dvou hodin od výroby, aby byla zachována životaschopnost fekálních bakterií.

Pro malý počet účastníků bude požadován druhý vzorek stolice (maximálně 3 účastníci). Cílem je vybrat jeden nízký, jeden střední a jeden vysoký ITC vylučovač. V ideálním případě by se nízké a vysoké vylučovače nacházely v rámci nejnižší a nejvyšší 5% exkrece ITC a třetí účastník by byl co nejblíže průměrnému vylučování ITC. Cílem je kultivace fekální mikroflóry v průběhu času opakovaným dávkováním glukorafaninu za účelem selekce mikroflóry, která je schopna metabolizovat glukorafanin. Je známo, že hlavní produkt hydrolýzy glukorafaninu, sulforafan, má řadu přínosů pro lidské zdraví, avšak není znám žádný klinický význam pro vysoký, střední nebo nízký vylučovač ITC.

Několik epidemiologických a intervenčních studií naznačuje, že zdravotní přínosy a fyziologická reakce na brukvovité zeleniny mohou být zprostředkovány individuálním genotypem GSTM1 (rodina genů glutathion-S-transferázy (GST). Když jsou ITC absorbovány do těla, konjugují se s glutathionem a jsou pak metabolizovány cestou kyseliny merkapturové. Ke konjugaci dochází spontánně díky relativně vysoké koncentraci glutathionu v buňkách ve srovnání s koncentrací ITC. Protože se však nekonjugované ITC vyskytují v plazmě, v určité fázi musí dojít k disociaci konjugátu ITC-thiol. Předpokládá se, že to může být katalyzováno enzymem GSTM1. Přibližně 50 % populace má homologní deleci genu GSTM1 vedoucí k nulovému genotypu a 20 % má deleci genu GSTT1. Existují některé studie, včetně jedné z našich, které naznačují, že genotyp GSTM1 může ovlivnit rychlost vylučování ITC v moči, ale nenaznačují, že genotyp GSTM1 ovlivňuje maximální koncentraci ITC v plazmě.

Nepublikované výsledky předchozí intervence, studie Diet and Vascular Health; Clinical Trials.gov: NCT01114399 přidali na důvěryhodnosti názoru, že nulové GSTM1 metabolizují sulforafan jiným způsobem než ty s funkční alelou GSTM1. Spolu s rodinou genů GST a jejich asociací s brukvovitou zeleninou mohou existovat další zajímavé geny, které mohou být schopny určit rozsah konverze glukorafaninu na sulforafan. Práce provedená na naší předchozí intervenci, studie Diet and Vascular Health, se snažila prozkoumat možné kandidátní geny. S podstatným dodatkem, který se snaží zaujmout globálnější přístup k identifikaci kandidátských genů zájmu provedením analýzy Affymetrix SNP na vzorcích od účastníků, kteří byli na dietě s vysokým obsahem glukorafaninu.

Proto bude určen genotyp GSTM1 a další, dosud neidentifikované kandidátní geny každého účastníka, aby bylo možné posoudit, zda genotyp ovlivňuje rychlost vylučování ITC v moči, buď samostatně, nebo v kombinaci s jejich fylogickým profilem. Každému účastníkovi bude odebrán vzorek krve o objemu 5 ml a extrahována DNA, pomocí PCR se pak otestuje, zda je gen přítomen či nikoliv.