La conversión de glucorafanina encapsulada, estudio de filogenia y gEnotipo de la microbiota intestinal (ENGAGE) (ENGAGE)

Los glucosinolatos (GSL) son fitoquímicos no volátiles que contienen azufre (metabolitos secundarios) que se encuentran en los tejidos vegetales de cultivos crucíferos, como el brócoli, el repollo y el berro. Los glucosinolatos se acumulan en estos alimentos, siendo la glucorafanina el glucosinolato predominante que se encuentra en el brócoli. Cuando el tejido se rompe, los glucosinolatos se convierten en isotiocianatos (ITC) por la enzima mirosinasa. El sulforafano es el ITC predominante obtenido por hidrólisis enzimática a partir de glucorafanina. Cuando las verduras se cocinan muy bien, la enzima mirosinasa se desnaturaliza, lo que da como resultado que las GSL pasen a través del tracto gastrointestinal (GI) hacia el colon.

Se ha demostrado que las ITC en estudios con animales ejercen diversos efectos biológicos, como efectos antioxidantes; Propiedades anti-inflamatorias; inhibición de la agregación plaquetaria; reducción de la presión arterial sistólica y reducción de los niveles de colesterol; todo lo cual reduce el riesgo de desarrollar enfermedades cardiovasculares. El sulforafano se ha relacionado con beneficios para la salud en humanos, como la quimioprevención del cáncer y ayudar a mantener un corazón sano.

Cuando se consumen verduras crucíferas cocidas, en las que se ha inactivado la enzima mirosinasa, parte de la microflora del colon produce una enzima similar a la mirosinasa que también puede convertir los glucosinolatos en ITC. Este proceso de conversión de microbiota intestinal de glucorafanina en ITC se elimina con antibióticos entéricos y limpieza intestinal. Se han realizado varios estudios in vitro con cultivos de bacterias puros y mixtos que confirman la capacidad de las cepas bacterianas que se encuentran en el intestino humano para metabolizar las GSL en cultivo. Se ha demostrado que el grado de conversión de GSL a ITC por parte de la microbiota intestinal humana varía mucho entre individuos, pero la tasa de conversión de determinaciones repetidas dentro de individuos es mucho más consistente. Un estudio reciente intentó correlacionar la conversión de glucosinolatos ex vivo por bacterias intestinales humanas con datos in vivo del metabolismo de glucosinolatos de un pequeño número de individuos, sin embargo, no se estableció un vínculo específico con bacterias especiales individuales.

Nuestro estudio es una intervención dietética humana en la que los participantes consumirán una cápsula que contiene 100 mg de glucorafanina purificada de brócoli. Los niveles de glucorafanina entregados por la cápsula son similares a una o dos porciones de brócoli. Como se trata de glucorafanina purificada, no hay enzima mirosinasa presente. Por lo tanto, toda la conversión de la glucorafanina, contenida dentro de la cápsula, en ITC se producirá mediante enzimas que se encuentran en la microbiota intestinal.

Se desconoce la capacidad de la glucorafanina de la cápsula para ser metabolizada a ITC por la microflora intestinal y se evaluará midiendo las ITC excretadas en la orina. En resumen, se solicitará a cada participante en el estudio que se abstenga de cualquier alimento que contenga glucosinolatos e ITC durante los tres días anteriores a la intervención dietética y durante las 24 horas adicionales durante la intervención. Se les pedirá que ayunen durante la noche anterior a la intervención del día del estudio y que en la mañana posterior al ayuno se recolecte una muestra de orina. Esto constituirá efectivamente una muestra de control negativo y se utilizará como medida del cumplimiento de la restricción dietética. Luego, al participante se le dará la cápsula de glucorafanina junto con su desayuno. La restricción dietética continuará durante 24 horas más, tiempo durante el cual el participante recolectará toda la orina que produzca. Los ITC se cuantificarán en orina mediante HP-LC y LC-MS utilizando métodos analíticos validados. Una vez que se complete la recolección de orina de 24 horas, cesará la restricción dietética.

Se ha demostrado en estudios de intervención dietética humana que el grado de conversión de glucosinolatos varía mucho. Con el fin de evaluar los posibles factores causantes de la variación en la tasa de metabolismo de la glucorafanina, cada participante proporcionará una muestra fecal a partir de la cual se analizará la filogenia de su microbiota intestinal fecal. Se proporcionará una descripción detallada de cómo se debe recolectar la muestra junto con todo el equipo necesario. Las muestras fecales se devolverán al científico del estudio dentro de las dos horas posteriores a la producción para mantener la viabilidad de las bacterias fecales.

Para un pequeño número de participantes se solicitará una segunda muestra fecal (un máximo de 3 participantes). El objetivo es seleccionar un excretor de ITC bajo, uno medio y uno alto. Idealmente, los excretores bajos y altos estarían dentro del 5% de excreción más bajo y más alto de ITC y el tercer participante estará lo más cerca posible de la excreción media de ITC. El objetivo es cultivar la microbiota fecal a lo largo del tiempo con dosis repetidas de glucorafanina para seleccionar microbiota que sea capaz de metabolizar la glucorafanina. Se sabe que el principal producto de hidrólisis de la glucorafanina, el sulforafano, tiene una variedad de beneficios para la salud humana, sin embargo, no se conoce relevancia clínica por ser un excretor alto, medio o bajo de ITC.

Varios estudios epidemiológicos y de intervención sugieren que los beneficios para la salud y la respuesta fisiológica a las verduras crucíferas pueden estar mediados por el genotipo GSTM1 de un individuo (familia de genes de glutatión-S-transferasas (GST)). Cuando los ITC se absorben en el cuerpo, se conjugan con el glutatión y luego se metabolizan a través de la vía del ácido mercaptúrico. La conjugación ocurre espontáneamente debido a la concentración relativamente alta de glutatión dentro de las células en comparación con la concentración de ITC. Sin embargo, dado que en el plasma se producen ITC no conjugados, en algún momento debe producirse una disociación del conjugado ITC-tiol. Se cree que esto puede ser catalizado por la enzima GSTM1. Aproximadamente el 50 % de la población tiene una deleción homóloga del gen GSTM1 que da como resultado un genotipo nulo, y el 20 % tiene una deleción del gen GSTT1. Hay algunos estudios, incluido uno propio, que sugieren que el genotipo GSTM1 puede afectar la tasa de excreción de ITC en la orina, pero no han sugerido que el genotipo GSTM1 afecte la concentración máxima de ITC en plasma.

Resultados no publicados de una intervención anterior, el estudio Diet and Vascular Health; Ensayos clínicos.gov: NCT01114399 ha agregado credibilidad a la idea de que los nulos de GSTM1 metabolizan el sulforafano de una manera diferente a aquellos con un alelo GSTM1 funcional. Junto con la familia de genes GST y su asociación con las verduras crucíferas, puede haber otros genes de interés que puedan determinar el grado de conversión de la glucorafanina en sulforafano. El trabajo realizado en nuestra intervención anterior, el estudio Diet and Vascular Health, ha buscado investigar posibles genes candidatos. Con una enmienda sustancial que busca adoptar un enfoque más global en la identificación de genes candidatos de interés mediante la realización de un análisis SNP de Affymetrix en muestras de participantes que habían estado en una dieta alta en glucorafanina.

Por lo tanto, se determinará el genotipo GSTM1 y otros genes candidatos aún no identificados de cada participante para evaluar si el genotipo afecta la tasa de excreción de ITC en la orina, ya sea solo o en combinación con su perfil filogenético. Se tomará una muestra de sangre de 5 ml de cada participante y se extraerá el ADN, luego se usará PCR para probar si el gen está presente o no.