De conversie van ENcapsulated GlucorAphanin, Gut Microbiota Phylogeny and gEnotype Study (ENGAGE) (ENGAGE)

Glucosinolaten (GSL's) zijn niet-vluchtige zwavelhoudende fytochemicaliën (secundaire metabolieten) die worden aangetroffen in plantenweefsels van kruisbloemige gewassen, zoals broccoli, kool en waterkers. Glucosinolaten hopen zich op in deze voedingsmiddelen, waarbij glucoraphanine het overheersende glucosinolaat is dat in broccoli wordt aangetroffen. Wanneer weefsel wordt verstoord, worden de glucosinolaten door het enzym myrosinase omgezet in isothiocyanaten (ITC's). Sulforafaan is de overheersende ITC verkregen door enzymatische hydrolyse uit glucoraphanine. Wanneer groenten zeer grondig worden gekookt, wordt het myrosinase-enzym gedenatureerd, wat ertoe leidt dat GSL's door het maagdarmkanaal (GI) naar de dikke darm gaan.

In dierstudies is aangetoond dat de ITC's verschillende biologische effecten hebben, zoals anti-oxidant effecten; ontstekingsremmende eigenschappen; remming van bloedplaatjesaggregatie; verlaging van de systolische bloeddruk en verlaging van het cholesterolgehalte; die allemaal het risico op het ontwikkelen van hart- en vaatziekten verminderen. Sulforafaan is in verband gebracht met gezondheidsvoordelen bij mensen, zoals chemopreventie bij kanker en het helpen behouden van een gezond hart.

Wanneer gekookte kruisbloemige groenten, waarin het myrosinase-enzym is geïnactiveerd, worden geconsumeerd, produceert een deel van de microflora in de dikke darm een ​​myrosinase-achtig enzym dat ook glucosinolaten kan omzetten in ITC's. Dit proces van darmmicrobiota-omzetting van glucoraphanine in ITC wordt afgeschaft door darmantibiotica en darmreiniging. Er zijn verschillende in-vitro-onderzoeken uitgevoerd met zowel zuivere als gemengde culturen van bacteriën die het vermogen bevestigen van bacteriestammen die in de menselijke darm worden aangetroffen en het vermogen hebben om GSL's in cultuur te metaboliseren. Het is aangetoond dat de mate van conversie van GSL's naar ITC's door menselijke darmmicrobiota sterk varieert tussen individuen, maar de conversieratio van herhaalde bepalingen binnen individuen is veel consistenter. Een recente studie probeerde de omzetting van glucosinolaat ex vivo door menselijke darmbacteriën te correleren met in vivo gegevens van het glucosinolaatmetabolisme van een klein aantal individuen, maar er werd geen specifiek verband met individuele bacteriespecialiteiten vastgesteld.

Onze studie is een menselijke voedingsinterventie waarbij deelnemers één capsule consumeren die 100 mg gezuiverde glucoraphanine uit broccoli bevat. De niveaus van glucoraphanine die door de capsule worden afgegeven, zijn vergelijkbaar met één tot twee porties broccoli. Aangezien dit gezuiverde glucoraphanine is, is er geen myrosinase-enzym aanwezig. Alle omzetting van de glucoraphanine, die zich in de capsule bevindt, in ITC zal daarom plaatsvinden door enzymen die in de darmmicrobiota worden aangetroffen.

Het vermogen van de glucoraphanine in de capsule om te worden gemetaboliseerd tot ITC's door de darmmicroflora is niet bekend en zal worden beoordeeld door meting van ITC's die worden uitgescheiden in de urine. In het kort zal elke deelnemer aan het onderzoek worden verzocht zich te onthouden van alle glucosinolaat- en ITC-bevattende voedingsmiddelen gedurende drie dagen voorafgaand aan de dieetinterventie en gedurende nog eens 24 uur tijdens de interventie. Ze zullen worden gevraagd om 's nachts voorafgaand aan de studiedaginterventie te vasten en op de ochtend na de vasten een urinemonster te verzamelen. Dit vormt in feite een negatief controlemonster en wordt gebruikt als maatstaf voor naleving van de dieetbeperking. De deelnemer krijgt dan de glucoraphanine-capsule bij het ontbijt. De dieetbeperking duurt nog 24 uur, gedurende welke tijd de deelnemer alle urine verzamelt die hij produceert. De ITC's zullen in urine worden gekwantificeerd door middel van HP-LC en LC-MS met behulp van gevalideerde analytische methoden. Zodra de 24-uurs urineverzameling is voltooid, wordt de dieetbeperking opgeheven.

In interventiestudies met menselijke voeding is aangetoond dat de mate van omzetting van glucosinolaten sterk varieert. Om mogelijke oorzakelijke factoren voor variatie in de snelheid van het glucoraphaninemetabolisme te beoordelen, zal elke deelnemer een fecaal monster verstrekken waaruit hun fecale darmmicrobiota fylogenie zal worden geanalyseerd. Een gedetailleerde beschrijving van hoe het monster moet worden verzameld, samen met alle benodigde apparatuur, wordt verstrekt. De fecesmonsters worden binnen twee uur na productie teruggestuurd naar de onderzoekswetenschapper om de levensvatbaarheid van de fecale bacteriën te behouden.

Bij een klein aantal deelnemers wordt een tweede fecesmonster gevraagd (maximaal 3 deelnemers). Het doel is om één lage, één medium en één hoge ITC excreter te selecteren. Idealiter zouden de lage en hoge uitscheidingsmiddelen binnen de laagste en hoogste 5% uitscheiding van ITC liggen en de derde deelnemer zo dicht mogelijk bij de gemiddelde ITC-uitscheiding. Het doel is om de fecale microbiota in de loop van de tijd te kweken met herhaalde dosering van glucoraphanine om microbiota te selecteren die in staat zijn om glucoraphanine te metaboliseren. Het is bekend dat het belangrijkste hydrolyseproduct van glucoraphanine, sulforafaan, verschillende voordelen heeft voor de gezondheid van de mens, maar er is geen klinische relevantie bekend om een ​​hoge, gemiddelde of lage excreter van ITC te zijn.

Verschillende epidemiologische en interventiestudies suggereren dat de gezondheidsvoordelen en fysiologische respons op kruisbloemige groenten kunnen worden gemedieerd door het GSTM1-genotype van een individu (glutathione-S-transferasen (GST) genfamilie). Wanneer ITC's in het lichaam worden opgenomen, conjugeren ze met glutathion en worden vervolgens gemetaboliseerd via de mercaptuurzuurroute. Conjugatie gebeurt spontaan vanwege de relatief hoge concentratie glutathion in cellen in vergelijking met de ITC-concentratie. Omdat er echter niet-geconjugeerde ITC's in het plasma voorkomen, moet er op een bepaald moment dissociatie zijn van het ITC-thiol-conjugaat. Aangenomen wordt dat dit kan worden gekatalyseerd door het GSTM1-enzym. Ongeveer 50% van de bevolking heeft een homologe deletie van het GSTM1-gen resulterend in een nulgenotype, en 20% heeft een deletie van het GSTT1-gen. Er zijn enkele onderzoeken, waaronder een van onze eigen, die suggereren dat het GSTM1-genotype de snelheid van ITC-uitscheiding in de urine kan beïnvloeden, maar hebben niet gesuggereerd dat het GSTM1-genotype de piekplasma-ITC-concentratie beïnvloedt.

Niet-gepubliceerde resultaten van een eerdere interventie, de studie Diet and Vascular Health; Klinische proeven.gov: NCT01114399 hebben geloofwaardigheid toegevoegd aan het idee dat GSTM1-nulls sulforafaan op een andere manier metaboliseren dan die met een functioneel GSTM1-allel. Naast de GST-genenfamilie en hun associatie met kruisbloemige groenten zijn er mogelijk andere interessante genen die de mate van glucoraphanine-omzetting in sulforafaan kunnen bepalen. Het werk dat is uitgevoerd aan onze eerdere interventie, de Diet and Vascular Health-studie, heeft getracht mogelijke kandidaat-genen te onderzoeken. Met een substantiële wijziging die een meer globale benadering zoekt bij het identificeren van interessante kandidaat-genen door een Affymetrix SNP-analyse uit te voeren op monsters van deelnemers die een dieet met veel glucoraphanine hadden gevolgd.

Daarom zullen het GSTM1-genotype en andere, tot nu toe niet-geïdentificeerde kandidaat-genen van elke deelnemer worden bepaald om te beoordelen of het genotype de snelheid van ITC-uitscheiding in de urine beïnvloedt, alleen of in combinatie met hun fylogenetische profiel. Van elke deelnemer wordt een bloedmonster van 5 ml genomen en het DNA wordt geëxtraheerd. PCR zal vervolgens worden gebruikt om te testen of het gen aanwezig is of niet.