Kohdennettu korkean suorituskyvyn sekvensointi lasten akuutin leukemian diagnosoinnissa

Akuutit leukemiat ovat heterogeeninen ryhmä hematologisia pahanlaatuisia kasvaimia. Ne johtuvat epäkypsistä soluista, joiden määrä on yli 20 % luuytimessä, kloonaalisesta laajenemisesta. Lapsuuden akuutit leukemiat ovat yleisimpiä lasten pahanlaatuisia kasvaimia. Euroopassa ja Yhdysvalloissa ne muodostavat noin 35 % lasten syövistä. Heistä 80 % on akuuttia lymfoblastista leukemiaa (ALL) ja 15-20 % akuuttia myeloidista leukemiaa (AML). Nykyiset hoidot mahdollistavat parantumisen noin 80 %:ssa ALL:ssa, kun taas tämä taso on vain 50 % AML:ssä. Akuutin leukemian diagnoosi perustuu leukemiasolujen monitieteiseen tutkimiseen eri tekniikoilla:

• Solu: sytologia, immunofenotyypitys ja sytokemia
• Sytogeneettinen: tavanomainen (karyotyyppi) ja molekyyli (FISH) sytogeneettinen
• Molekyyli: RT-PCR ja RQ-PCR

Sytogeneettiset tutkimukset suoritetaan akuutin leukemian diagnoosin yhteydessä. WHO:n vuoden 2008 akuutin leukemian luokitus perustuukin suurelta osin toistuviin sytogeneettisiin ja molekyylihäiriöihin. Yleisimmät kromosomipoikkeamat on liitetty tiettyihin kliinisiin ja biologisiin ominaisuuksiin, ja niitä käytetään nyt diagnoosi- ja prognostisina markkereina. Nämä kromosomaaliset poikkeavuudet vaikuttavat geeneihin, jotka osallistuvat leukemogeneesiprosessiin. Näitä uudelleenjärjestelyjä on useita tyyppejä:

• Fuusiogeenit aiheuttavat:

  • Hematopoieettisten solujen erilaistumiseen osallistuvien geenien (AML1-ETO, PML-RARA…) transkriptionaalisen aktiivisuuden tukahduttaminen
  • Signaalinvälitysreitin deregulaatio (esim. BCR-ABL kimeerinen proteiini, jolla on konstitutiivista tyrosiinikinaasiaktiivisuutta)
  • Kromatiinin kondensaation tilan muutos, mikä johtaa transkription muutoksiin (MLL-geenin uudelleenjärjestelyt 11q23:ssa, MOZ en 8p11…)
• Geenien ilmentymisen purkaminen: kromosomaaliset uudelleenjärjestelyt voivat joskus aiheuttaa viereisten geenien säätelyn purkamista katkaisupisteeseen. Esimerkiksi inv(3)(q21q26) tai t(3;3)(q21;q26) indusoivat transkriptiotekijän EVI-1 yliekspression.
• Toiminnan menetys johtuen vaihtelevan koon deleetiosta genomilla alueilla, jotka sisältävät geenejä, joilla on rooli erilaistumisessa, apoptoosissa tai solujen lisääntymisessä (esim. IKZF1, PAX5…)

Lisäksi karyotyyppi, joka mahdollistaa globaalin kuvan genomista; FISH:ia, kohdennettua tekniikkaa, käytetään korostamaan karyotyypin näkymättömiä poikkeavuuksia (salaperäisiä poikkeavuuksia) tai karyotyypin epäonnistumisen ajankohtaa. Perinteiset ja molekyyliset sytogeneettiset tekniikat eivät kuitenkaan tuo esiin mitään poikkeavuuksia (esim. fuusiogeenien muodostumiseen osallistuvat eri osapuolet, erityisesti MLL-geenien uudelleenjärjestely, mutaatiot), ja siksi olemme kiinnostuneita seuraavan sukupolven sekvensoinnista. RNA-seq) on se etu, että se mahdollistaa erityyppisten mutaatioiden tunnistamisen yhdessä testissä, lukuun ottamatta epigeneettisiä mutaatioita. RNA:iden sekvensoinnin merkitys DNA:n genomisen sijaan on toisaalta erittäin merkittävä analysoitavien sekvenssien määrän väheneminen, koska transkriptoidut mRNA-geenit edustavat noin 5 % genomin koosta, ja toisaalta kimeeristen geenien parempi tunnistaminen. RNA-seq:tä on käytetty hematologisten pahanlaatuisten kasvainten tutkimustyökaluna. Tämän projektin tarkoituksena on kehittää innovatiivisen teknologian avulla uusi diagnostinen ja prognostinen työkalu hematologisten pahanlaatuisten kasvainten hoitoon. 50 akuuttia leukemiaa testataan ja tulokset analysoidaan kolmen kriteerin mukaan:

• Diagnoosissa, seurannassa ja terapeuttisessa hallinnassa tarjotun tiedon määrä, laatu ja relevanssi verrattuna tavanomaiseen strategiaan
• Aika, joka vaaditaan tulosten saamiseksi ja menetelmät analyysiajan lyhentämiseksi, jotta tulokset voidaan integroida terapeuttisiin päätöksiin.
• Taloudellinen arviointi, joka laskee tämän diagnoosivaihtoehdon kustannukset ja arvioi kustannus-hyötysuhteen Jatkossa otetaan käyttöön muita innovatiivisia lähestymistapoja (genomisten poikkeavuuksien epätasapainon tutkimus array-CGH:lla, transkriptioanalyysi mikrosirulla ja metylomin tutkimus ) tunnistaa kunkin leukemian "molekyylinen allekirjoitus" ja joukko informatiivisia poikkeavuuksia sairauden diagnosointia, ennustamista ja hoitoa sekä jäännössairauden seurantaa varten.