Gerichte High Throughput Sequencing bij de diagnose van pediatrische acute leukemie

Acute leukemieën zijn een heterogene groep van hematologische maligniteiten. Ze zijn het resultaat van klonale expansie van onrijpe cellen waarvan het aantal groter is dan 20% in het beenmerg. Acute leukemieën bij kinderen zijn de meest voorkomende maligniteiten bij kinderen. In Europa en de Verenigde Staten vertegenwoordigen ze ongeveer 35% van de kankers bij kinderen. 80% daarvan is acute lymfoblastische leukemie (ALL) en 15-20% acute myeloïde leukemie (AML). De huidige behandelingen maken genezing mogelijk bij ongeveer 80% van ALL, terwijl dit niveau slechts 50% is bij AML. De diagnose van acute leukemie is gebaseerd op multidisciplinair onderzoek van leukemiecellen met verschillende technieken:

• Cellulair: cytologie, immunofenotypering en cytochemie
• Cytogenetisch: conventioneel (karyotype) en moleculair (FISH) cytogenetisch
• Moleculair: RT-PCR en RQ-PCR

Cytogenetische onderzoeken worden uitgevoerd op het moment van de diagnose van acute leukemie. Inderdaad, de WHO-classificatie van acute leukemie uit 2008 is grotendeels gebaseerd op de aanwezigheid van recidiverende cytogenetische en moleculaire afwijkingen. De meest voorkomende chromosomale afwijkingen zijn in verband gebracht met specifieke klinische en biologische kenmerken en worden nu gebruikt als diagnose en prognostische markers. Deze chromosomale afwijkingen beïnvloeden genen die betrokken zijn bij het leukemogenese-proces. Deze herschikkingen zijn van verschillende typen:

• Fusiegenen veroorzaken:

  • Onderdrukking van transcriptionele activiteit van genen die betrokken zijn bij de differentiatie van hematopoietische cellen (AML1-ETO, PML-RARA…)
  • Deregulering van signaaltransductieroute (bijv. BCR-ABL chimeer eiwit met constitutieve tyrosinekinase-activiteit)
  • Verandering in de toestand van chromatinecondensatie resulterende veranderingen in transcriptie (MLL-genherschikkingen in 11q23, MOZ en 8p11…)
• Deregulering van genexpressie: chromosomale herschikkingen kunnen soms leiden tot deregulering van aangrenzende genen tot aan het breekpunt. Inv(3)(q21q26) of t(3;3)(q21;q26) induceren bijvoorbeeld overexpressie van transcriptiefactor EVI-1.
• Functieverlies door deletie van variabele grootte in genomische regio's die genen bevatten die een rol spelen bij de differentiatie, apoptose of celproliferatie (bijv. IKZF1, PAX5...)

Naast het karyotype, dat een globaal beeld van het genoom mogelijk maakt; FISH, een gerichte techniek, wordt gebruikt om onzichtbare afwijkingen op het karyotype (cryptische afwijkingen) of het tijdstip van het falen van het karyotype te markeren. Conventionele en moleculaire cytogenetische technieken brengen echter geen afwijkingen aan het licht (bijv. verschillende partners die betrokken zijn bij de vorming van fusiegenen, in het bijzonder voor herschikking van MLL-genen, mutaties), vandaar onze interesse in sequencing van de volgende generatie. RNA-seq) heeft het voordeel dat het mogelijk is om verschillende soorten mutaties in één enkele test te identificeren, met uitzondering van epigenetische mutaties. Het belang van RNA-sequencing in plaats van DNA-genoom is enerzijds een zeer significante afname van het volume van de te analyseren sequenties omdat getranscribeerde mRNA-genen ongeveer 5% van de genoomgrootte vertegenwoordigen en anderzijds een betere identificatie van chimere genen. De RNA-seq is gebruikt als onderzoeksinstrument bij hematologische maligniteiten. Het doel van dit project is om innovatieve technologie te gebruiken om een ​​nieuw diagnostisch en prognostisch nieuw hulpmiddel voor hematologische maligniteiten te ontwikkelen. 50 acute leukemieën zullen worden getest en de resultaten zullen worden geanalyseerd volgens drie criteria:

• Kwantiteit, kwaliteit en relevantie van de verstrekte informatie voor de diagnose, monitoring en therapeutisch beheer in vergelijking met een conventionele strategie
• Periode die nodig is om resultaten te verkrijgen en methoden om de analysetijd te verkorten, zodat resultaten kunnen worden geïntegreerd in therapeutische beslissingen.
• Economische evaluatie, die de kosten van deze diagnoseoptie zal berekenen en de kosten/batenverhouding zal beoordelen. In de toekomst zullen andere innovatieve benaderingen worden geïmplementeerd (studie van onevenwichtigheden in genomische afwijkingen door array-CGH, ​​transcriptoomanalyse met micro-array en studie van methylome ) om de "moleculaire handtekening" van elke leukemie en een reeks informatieve afwijkingen te identificeren voor diagnose, prognose en behandeling van ziekte en monitoring van resterende ziekte.