Sequenziamento mirato ad alto rendimento nella diagnosi della leucemia acuta pediatrica

Le leucemie acute sono un gruppo eterogeneo di neoplasie ematologiche. Derivano dall'espansione clonale di cellule immature il cui numero è superiore al 20% nel midollo osseo. Le leucemie acute dell'infanzia sono le neoplasie pediatriche più comuni. In Europa e negli Stati Uniti rappresentano circa il 35% dei tumori infantili. L'80% di loro sono leucemia linfoblastica acuta (ALL) e il 15-20% di leucemia mieloide acuta (AML). I trattamenti attuali consentono una cura in circa l'80% di ALL, mentre questo livello è solo del 50% in AML. La diagnosi di leucemia acuta si basa sull'esplorazione multidisciplinare delle cellule leucemiche mediante diverse tecniche:

• Cellulare: citologia, immunofenotipizzazione e citochimica
• Citogenetica: citogenetica convenzionale (cariotipo) e molecolare (FISH).
• Molecolare: RT-PCR e RQ-PCR

Gli studi citogenetici vengono eseguiti al momento della diagnosi di leucemia acuta. In effetti, la classificazione OMS 2008 della leucemia acuta si basa in gran parte sulla presenza di anomalie citogenetiche e molecolari ricorrenti. Le aberrazioni cromosomiche più frequenti sono state associate a specifiche caratteristiche cliniche e biologiche e sono ora utilizzate come marcatori diagnostici e prognostici. Queste anomalie cromosomiche influenzano i geni coinvolti nel processo di leucemogenesi. Questi riarrangiamenti sono di diversi tipi:

• Geni di fusione che causano:

  • Repressione dell'attività trascrizionale dei geni coinvolti nella differenziazione delle cellule ematopoietiche (AML1-ETO, PML-RARA…)
  • Deregolazione della via di trasduzione del segnale (es. proteina chimerica BCR-ABL con attività costitutiva tirosin-chinasica)
  • Modifica dello stato di condensazione della cromatina con conseguenti modifiche della trascrizione (riarrangiamenti del gene MLL in 11q23, MOZ en 8p11…)
• Deregolazione dell'espressione genica: i riarrangiamenti cromosomici possono talvolta indurre la deregolazione dei geni adiacenti al punto di interruzione. Ad esempio, inv(3)(q21q26) o t(3;3)(q21;q26) inducono una sovraespressione del fattore trascrizionale EVI-1.
• Perdita di funzione dovuta alla delezione di dimensioni variabili nelle regioni genomiche contenenti geni con un ruolo nella differenziazione, nell'apoptosi o nella proliferazione cellulare (es. IKZF1, PAX5…)

Oltre al cariotipo, che permette di avere una visione globale del genoma; La FISH, una tecnica mirata, viene utilizzata per evidenziare anomalie invisibili sul cariotipo (anomalie criptiche) o il tempo di fallimento del cariotipo. Tuttavia, le tecniche citogenetiche convenzionali e molecolari non evidenziano alcuna anomalia (ad es. diversi partner coinvolti nella formazione di geni di fusione in particolare per il riarrangiamento del gene MLL, mutazioni) da qui il nostro interesse per il sequenziamento di nuova generazione. RNA-seq) ha il vantaggio di consentire l'identificazione di diversi tipi di mutazioni in un singolo test, ad eccezione delle mutazioni epigenetiche. L'importanza del sequenziamento degli RNA piuttosto che della genomica del DNA è da un lato, una diminuzione molto significativa del volume delle sequenze da analizzare perché i geni mRNA trascritti rappresentano circa il 5% della dimensione del genoma e, dall'altro, una migliore identificazione dei geni chimerici. L'RNA-seq è stato utilizzato come strumento di ricerca nelle neoplasie ematologiche. Lo scopo di questo progetto è quello di utilizzare una tecnologia innovativa per sviluppare un nuovo strumento diagnostico e prognostico nelle neoplasie ematologiche. Saranno testate 50 leucemie acute e i risultati saranno analizzati secondo tre criteri:

• Quantità, qualità e rilevanza delle informazioni fornite per la diagnosi, il monitoraggio e la gestione terapeutica rispetto a una strategia convenzionale
• Periodo necessario per ottenere risultati e metodi per diminuire il tempo di analisi in modo che i risultati possano essere integrati nelle decisioni terapeutiche.
• Valutazione economica, che calcolerà il costo di questa opzione diagnostica e valuterà il rapporto costi/benefici In futuro verranno implementati altri approcci innovativi (studio degli squilibri anomalie genomiche mediante array-CGH, ​​analisi del trascrittoma con micro-array e studio del metiloma ) per identificare la "firma molecolare" di ogni leucemia e insieme di anomalie informative per la diagnosi, la prognosi e il trattamento della malattia e il monitoraggio della malattia residua.