Séquençage ciblé à haut débit dans le diagnostic de la leucémie aiguë pédiatrique

Les leucémies aiguës sont un groupe hétérogène d'hémopathies malignes. Elles résultent de l'expansion clonale de cellules immatures dont le nombre est supérieur à 20 % dans la moelle osseuse. Les leucémies aiguës de l'enfant sont les tumeurs malignes pédiatriques les plus fréquentes. En Europe et aux États-Unis, ils représentent environ 35 % des cancers de l'enfant. 80 % d'entre elles sont des leucémies aiguës lymphoblastiques (LAL) et 15 à 20 % des leucémies aiguës myéloïdes (LAM). Les traitements actuels permettent une guérison dans environ 80% des LAL, alors que ce taux n'est que de 50% dans les LAM. Le diagnostic des leucémies aiguës repose sur l'exploration multidisciplinaire des cellules leucémiques par différentes techniques :

• Cellulaire : cytologie, immunophénotypage et cytochimie
• Cytogénétique : cytogénétique conventionnelle (caryotype) et moléculaire (FISH)
• Moléculaire : RT-PCR et RQ-PCR

Des études cytogénétiques sont réalisées au moment du diagnostic de leucémie aiguë. En effet, la classification OMS 2008 des leucémies aiguës repose en grande partie sur la présence d'anomalies cytogénétiques et moléculaires récurrentes. Les aberrations chromosomiques les plus fréquentes ont été associées à des caractéristiques cliniques et biologiques spécifiques et sont maintenant utilisées comme marqueurs diagnostiques et pronostiques. Ces anomalies chromosomiques affectent les gènes impliqués dans le processus de leucémogenèse. Ces réaménagements sont de plusieurs types :

• Gènes de fusion provoquant :

  • Répression de l'activité transcriptionnelle de gènes impliqués dans la différenciation des cellules hématopoïétiques (AML1-ETO, PML-RARA…)
  • Dérégulation de la voie de transduction du signal (par exemple, protéine chimérique BCR-ABL à activité tyrosine kinase constitutive)
  • Modification de l'état de condensation de la chromatine entraînant des changements de transcription (réarrangements du gène MLL en 11q23, MOZ en 8p11…)
• Dérégulation de l'expression des gènes : des réarrangements chromosomiques peuvent parfois induire une dérégulation des gènes adjacents au breakpoint. Par exemple, inv(3)(q21q26) ou t(3;3)(q21;q26) induisent une surexpression du facteur transcriptionnel EVI-1.
• Perte de fonction due à une délétion de taille variable dans des régions génomiques contenant des gènes ayant un rôle dans la différenciation, l'apoptose ou la prolifération cellulaire (ex IKZF1, PAX5…)

En plus du caryotype, qui permet d'avoir une vision globale du génome ; Le FISH, technique ciblée, permet de mettre en évidence des anomalies invisibles sur le caryotype (anomalies cryptiques) ou le moment de l'échec du caryotype. Cependant, les techniques de cytogénétique conventionnelle et moléculaire ne mettent pas en évidence d'anomalies (ex. différents partenaires impliqués dans la formation des gènes de fusion notamment pour le réarrangement du gène MLL, les mutations) d'où notre intérêt pour le séquençage de nouvelle génération. En effet, le séquençage à haut débit ciblé des ARN messagers ( RNA-seq) a l'avantage de permettre l'identification de différents types de mutations en un seul test, à l'exception des mutations épigénétiques. L'importance du séquençage des ARN plutôt que de l'ADN génomique est d'une part, une diminution très significative du volume de séquences à analyser car les gènes ARNm transcrits représentent environ 5% de la taille du génome et d'autre part, une meilleure identification des gènes chimériques. L'ARN-seq a été utilisé comme outil de recherche dans les hémopathies malignes. L'objectif de ce projet est d'utiliser une technologie innovante pour développer un nouvel outil de diagnostic et de pronostic des hémopathies malignes. 50 leucémies aiguës seront testées et les résultats seront analysés selon trois critères :

• Quantité, qualité et pertinence des informations fournies pour le diagnostic, le suivi et la prise en charge thérapeutique par rapport à une stratégie conventionnelle
• Délai nécessaire pour obtenir des résultats et méthodes pour diminuer le temps d'analyse afin que les résultats puissent être intégrés dans les décisions thérapeutiques.
• Evaluation économique, qui permettra de calculer le coût de cette option diagnostic et d'évaluer le rapport coût/bénéfice Dans le futur, d'autres approches innovantes seront mises en œuvre (étude des déséquilibres des anomalies génomiques par array-CGH, ​​analyse du transcriptome par micro-array, et étude du méthylome ) pour identifier la "signature moléculaire" de chaque leucémie et un ensemble d'anomalies informatives pour le diagnostic, le pronostic et le traitement de la maladie et le suivi de la maladie résiduelle.