Secuenciación dirigida de alto rendimiento en el diagnóstico de la leucemia aguda pediátrica

Las leucemias agudas son un grupo heterogéneo de neoplasias hematológicas. Resultan de la expansión clonal de células inmaduras cuyo número es superior al 20% en la médula ósea. Las leucemias agudas infantiles son las neoplasias malignas pediátricas más comunes. En Europa y Estados Unidos representan alrededor del 35% de los cánceres infantiles. El 80% de ellos son leucemia linfoblástica aguda (LLA) y el 15-20% leucemia mieloide aguda (LMA). Los tratamientos actuales permiten una cura en aproximadamente el 80 % de la LLA, mientras que este nivel es solo del 50 % en la LMA. El diagnóstico de la leucemia aguda se basa en la exploración multidisciplinar de las células leucémicas mediante diferentes técnicas:

• Celular: citología, inmunofenotipado y citoquímica
• Citogenética: citogenética convencional (cariotipo) y molecular (FISH)
• Moleculares: RT-PCR y RQ-PCR

Los estudios citogenéticos se realizan en el momento del diagnóstico de leucemia aguda. De hecho, la clasificación de leucemia aguda de la OMS de 2008 se basa en gran medida en la presencia de anomalías citogenéticas y moleculares recurrentes. Las aberraciones cromosómicas más frecuentes se han asociado con características clínicas y biológicas específicas y ahora se utilizan como marcadores de diagnóstico y pronóstico. Estas anomalías cromosómicas afectan a genes implicados en el proceso de leucemogénesis. Estos reordenamientos son de varios tipos:

• Genes de fusión que causan:

  • Represión de la actividad transcripcional de genes implicados en la diferenciación de células hematopoyéticas (AML1-ETO, PML-RARA…)
  • Desregulación de la vía de transducción de señales (por ejemplo, proteína quimérica BCR-ABL con actividad de tirosina quinasa constitutiva)
  • Cambio en el estado de condensación de la cromatina que resulta en cambios de transcripción (reordenamientos del gen MLL en 11q23, MOZ en 8p11…)
• Desregulación de la expresión de genes: los reordenamientos cromosómicos a veces pueden inducir la desregulación de genes adyacentes hasta el punto de ruptura. Por ejemplo, inv(3)(q21q26) o t(3;3)(q21;q26) inducen la sobreexpresión del factor transcripcional EVI-1.
• Pérdida de función por deleción de tamaño variable en regiones genómicas que contienen genes con un papel en la diferenciación, apoptosis o proliferación celular (ej. IKZF1, PAX5…)

Además del cariotipo, que permite tener una visión global del genoma; FISH, una técnica dirigida, se utiliza para resaltar anomalías invisibles en el cariotipo (anomalías crípticas) o el momento de la falla del cariotipo. Sin embargo, las técnicas de citogenética molecular y convencional no destacan ninguna anormalidad (por ejemplo, diferentes socios involucrados en la formación de genes de fusión, en particular para el reordenamiento del gen MLL, mutaciones), de ahí nuestro interés en la secuenciación de próxima generación. De hecho, los ARN mensajeros de secuenciación dirigida de alto rendimiento ( RNA-seq) tiene la ventaja de permitir la identificación de diferentes tipos de mutaciones en una sola prueba, a excepción de las mutaciones epigenéticas. La importancia de la secuenciación de ARN en lugar de ADN genómico es, por un lado, una disminución muy significativa en el volumen de secuencias a analizar porque los genes de ARNm transcritos representan alrededor del 5% del tamaño del genoma y, por otro lado, una mejor identificación de genes quiméricos. El RNA-seq se ha utilizado como herramienta de investigación en neoplasias hematológicas. El propósito de este proyecto es utilizar tecnología innovadora para desarrollar una nueva herramienta de diagnóstico y pronóstico en neoplasias malignas hematológicas. Se probarán 50 leucemias agudas y los resultados se analizarán de acuerdo con tres criterios:

• Cantidad, calidad y relevancia de la información proporcionada para el diagnóstico, seguimiento y manejo terapéutico frente a una estrategia convencional
• Periodo requerido para obtener resultados y métodos para disminuir el tiempo de análisis para que los resultados puedan integrarse en las decisiones terapéuticas.
• Evaluación económica, que calculará el coste de esta opción diagnóstica y evaluará la relación coste/beneficio. En el futuro, se implementarán otros enfoques innovadores (estudio de anomalías genómicas de desequilibrios por array-CGH, ​​análisis de transcriptoma con microarray y estudio de metiloma). ) para identificar la "firma molecular" de cada leucemia y un conjunto de anomalías informativas para el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de la enfermedad y seguimiento de la enfermedad residual.