Ukierunkowane sekwencjonowanie o dużej przepustowości w diagnostyce ostrej białaczki u dzieci

Ostre białaczki to heterogenna grupa nowotworów hematologicznych. Powstają w wyniku ekspansji klonalnej niedojrzałych komórek, których liczba w szpiku kostnym przekracza 20%. Ostre białaczki wieku dziecięcego są najczęstszymi nowotworami złośliwymi wieku dziecięcego. W Europie i Stanach Zjednoczonych stanowią około 35% nowotworów wieku dziecięcego. 80% z nich to ostra białaczka limfoblastyczna (ALL), a 15-20% to ostra białaczka szpikowa (AML). Obecne metody leczenia pozwalają na wyleczenie około 80% ALL, podczas gdy ten poziom wynosi tylko 50% w AML. Diagnoza ostrej białaczki opiera się na multidyscyplinarnej eksploracji komórek białaczkowych za pomocą różnych technik:

• Komórkowy: cytologia, immunofenotypowanie i cytochemia
• Cytogenetyka: cytogenetyka konwencjonalna (kariotyp) i molekularna (FISH).
• Molekularne: RT-PCR i RQ-PCR

Badania cytogenetyczne wykonuje się w momencie rozpoznania ostrej białaczki. Rzeczywiście, klasyfikacja WHO 2008 ostrej białaczki opiera się głównie na obecności nawracających nieprawidłowości cytogenetycznych i molekularnych. Najczęstsze aberracje chromosomowe zostały powiązane z określonymi cechami klinicznymi i biologicznymi i są obecnie wykorzystywane jako markery diagnostyczne i prognostyczne. Te nieprawidłowości chromosomalne wpływają na geny biorące udział w procesie leukemogenezy. Te przegrupowania są kilku typów:

• Geny fuzyjne powodujące:

  • Represja aktywności transkrypcyjnej genów biorących udział w różnicowaniu komórek krwiotwórczych (AML1-ETO, PML-RARA…)
  • Deregulacja szlaku transdukcji sygnału (np. białko chimeryczne BCR-ABL z konstytutywną aktywnością kinazy tyrozynowej)
  • Zmiana stanu kondensacji chromatyny skutkująca zmianami transkrypcji (rearanżacje genu MLL w 11q23, MOZ en 8p11…)
• Deregulacja ekspresji genów: rearanżacje chromosomalne mogą czasami wywoływać deregulację genów sąsiadujących z punktem przerwania. Na przykład inv(3)(q21q26) lub t(3;3)(q21;q26) indukują nadekspresję czynnika transkrypcyjnego EVI-1.
• Utrata funkcji spowodowana delecją zmiennej wielkości w regionach genomowych zawierających geny odgrywające rolę w różnicowaniu, apoptozie lub proliferacji komórek (np. IKZF1, PAX5…)

Oprócz kariotypu, który pozwala mieć globalny obraz genomu; FISH, ukierunkowana technika, jest stosowana do uwypuklenia niewidocznych nieprawidłowości w kariotypie (tajemnicze nieprawidłowości) lub czasu uszkodzenia kariotypu. Jednak konwencjonalne i molekularne techniki cytogenetyczne nie ujawniają żadnych nieprawidłowości (np. różni partnerzy zaangażowani w tworzenie genów fuzyjnych, w szczególności rearanżacji genów MLL, mutacji), stąd nasze zainteresowanie sekwencjonowaniem nowej generacji. RNA-seq) ma tę zaletę, że umożliwia identyfikację różnych typów mutacji w jednym teście, z wyjątkiem mutacji epigenetycznych. Znaczenie sekwencjonowania RNA zamiast genomowego DNA polega z jednej strony na bardzo znaczącym zmniejszeniu objętości sekwencji do analizy, ponieważ transkrybowane geny mRNA stanowią około 5% wielkości genomu, az drugiej strony na lepszej identyfikacji genów chimerycznych. Sekwencja RNA została wykorzystana jako narzędzie badawcze w nowotworach hematologicznych. Celem tego projektu jest wykorzystanie innowacyjnej technologii do opracowania nowego narzędzia diagnostycznego i prognostycznego w nowotworach hematologicznych. Przebadanych zostanie 50 ostrych białaczek, a wyniki zostaną przeanalizowane według trzech kryteriów:

• Ilość, jakość i przydatność informacji dostarczanych do diagnozy, monitorowania i postępowania terapeutycznego w porównaniu ze strategią konwencjonalną
• Okres wymagany do uzyskania wyników i metody pozwalające skrócić czas analizy, tak aby wyniki mogły być zintegrowane z decyzjami terapeutycznymi.
• Ocena ekonomiczna, która obliczy koszt tej opcji diagnostycznej i oceni stosunek kosztów do korzyści W przyszłości zostaną wdrożone inne innowacyjne podejścia (badanie nierównowagi nieprawidłowości genomowych za pomocą macierzy-CGH, ​​analiza transkryptomu za pomocą mikromacierzy oraz badanie metylomu ) w celu zidentyfikowania „sygnatury molekularnej” każdej białaczki i zestawu nieprawidłowości informacyjnych do diagnozowania, prognozowania i leczenia choroby oraz monitorowania choroby resztkowej.