Sequenciamento direcionado de alto rendimento no diagnóstico de leucemia aguda pediátrica

As leucemias agudas são um grupo heterogêneo de neoplasias hematológicas. Resultam da expansão clonal de células imaturas cujo número é superior a 20% na medula óssea. As leucemias agudas da infância são as neoplasias pediátricas mais comuns. Na Europa e nos Estados Unidos, representam cerca de 35% dos cânceres infantis. 80% deles são leucemia linfoblástica aguda (ALL) e 15-20% de leucemia mielóide aguda (LMA). Os tratamentos atuais permitem a cura em cerca de 80% da LLA, enquanto esse nível é de apenas 50% na LMA. O diagnóstico de leucemia aguda é baseado na exploração multidisciplinar de células leucêmicas por diferentes técnicas:

• Celular: citologia, imunofenotipagem e citoquímica
• Citogenética: citogenética convencional (cariótipo) e molecular (FISH)
• Molecular: RT-PCR e RQ-PCR

Estudos citogenéticos são realizados no momento do diagnóstico de leucemia aguda. De fato, a classificação da OMS de 2008 para leucemia aguda é amplamente baseada na presença de anormalidades citogenéticas e moleculares recorrentes. As aberrações cromossômicas mais frequentes têm sido associadas a características clínicas e biológicas específicas e são hoje utilizadas como marcadores diagnósticos e prognósticos. Essas anormalidades cromossômicas afetam genes envolvidos no processo de leucemogênese. Esses rearranjos são de vários tipos:

• Genes de fusão causando:

  • Repressão da atividade transcricional de genes envolvidos na diferenciação de células hematopoiéticas (AML1-ETO, PML-RARA…)
  • Desregulação da via de transdução de sinal (por exemplo, proteína quimérica BCR-ABL com atividade constitutiva de tirosina quinase)
  • Alteração no estado de condensação da cromatina resultando em alterações da transcrição (rearranjos de genes MLL em 11q23, MOZ en 8p11…)
• Desregulação da expressão de genes: rearranjos cromossômicos podem, às vezes, induzir desregulação de genes adjacentes ao ponto de interrupção. Por exemplo, inv(3)(q21q26) ou t(3;3)(q21;q26) induzem a superexpressão do fator de transcrição EVI-1.
• Perda de função devido à deleção de tamanho variável em regiões genômicas contendo genes com papel na diferenciação, apoptose ou proliferação celular (por exemplo, IKZF1, PAX5…)

Além do cariótipo, que permite ter uma visão global do genoma; FISH, uma técnica direcionada, é usada para destacar anormalidades invisíveis no cariótipo (anormalidades crípticas) ou o tempo de falha do cariótipo. No entanto, as técnicas citogenéticas convencionais e moleculares não destacam nenhuma anormalidade (por exemplo, diferentes parceiros envolvidos na formação de genes de fusão, em particular para rearranjo de genes MLL, mutações), daí nosso interesse no sequenciamento de próxima geração. RNA-seq) tem a vantagem de permitir a identificação de diferentes tipos de mutações em um único teste, com exceção das mutações epigenéticas. A importância da sequenciação de ARNs em vez da genômica do ADN é, por um lado, uma diminuição muito significativa no volume de sequências a analisar porque os genes de ARNm transcritos representam cerca de 5% do tamanho do genoma e, por outro, uma melhor identificação de genes quiméricos. O RNA-seq tem sido utilizado como ferramenta de pesquisa em neoplasias hematológicas. O objetivo deste projeto é usar tecnologia inovadora para desenvolver uma nova ferramenta de diagnóstico e prognóstico em neoplasias hematológicas. Serão testadas 50 leucemias agudas e os resultados serão analisados ​​de acordo com três critérios:

• Quantidade, qualidade e relevância das informações fornecidas para o diagnóstico, monitoramento e manejo terapêutico em comparação com uma estratégia convencional
• Período necessário para obter resultados e métodos para diminuir o tempo de análise para que os resultados possam ser integrados às decisões terapêuticas.
• Avaliação econômica, que calculará o custo dessa opção de diagnóstico e avaliará a relação custo/benefício No futuro, outras abordagens inovadoras serão implementadas (estudo de anormalidades genômicas de desequilíbrios por array-CGH, ​​análise de transcriptoma com micro-array e estudo de metiloma ) para identificar a "assinatura molecular" de cada leucemia e conjunto de anormalidades informativas para diagnóstico, prognóstico e tratamento da doença e monitoramento da doença residual.