Cílené vysokovýkonné sekvenování v diagnostice dětské akutní leukémie

Akutní leukémie jsou heterogenní skupinou hematologických malignit. Jsou výsledkem klonální expanze nezralých buněk, jejichž počet je v kostní dřeni vyšší než 20 %. Akutní leukémie v dětství jsou nejčastějšími dětskými malignitami. V Evropě a Spojených státech představují asi 35 % dětských rakovin. 80 % z nich tvoří akutní lymfoblastická leukémie (ALL) a 15–20 % akutní myeloidní leukémie (AML). Současná léčba umožňuje vyléčit asi 80 % ALL, zatímco u AML je tato úroveň pouze 50 %. Diagnóza akutní leukémie je založena na multidisciplinárním zkoumání leukemických buněk různými technikami:

• Buněčné: cytologie, imunofenotypizace a cytochemie
• Cytogenetická: konvenční (karyotyp) a molekulární (FISH) cytogenetická
• Molekulární: RT-PCR a RQ-PCR

Cytogenetické studie se provádějí v době diagnózy akutní leukémie. Klasifikace akutní leukémie WHO z roku 2008 je skutečně založena převážně na přítomnosti rekurentních cytogenetických a molekulárních abnormalit. Nejčastější chromozomální aberace byly spojeny se specifickými klinickými a biologickými charakteristikami a nyní se používají jako diagnostické a prognostické markery. Tyto chromozomální abnormality ovlivňují geny zapojené do procesu leukemogeneze. Tyto přestavby jsou několika typů:

• Fúzní geny způsobující:

  • Represe transkripční aktivity genů podílejících se na diferenciaci krvetvorných buněk (AML1-ETO, PML-RARA…)
  • Deregulace signální transdukční dráhy (např. chimérický protein BCR-ABL s konstitutivní tyrosinkinázovou aktivitou)
  • Změna stavu kondenzace chromatinu vedoucí ke změnám transkripce (přeuspořádání genu MLL v 11q23, MOZ en 8p11…)
• Deregulace exprese genů: chromozomální přestavby mohou někdy vyvolat deregulaci sousedních genů k bodu zlomu. Například inv(3)(q21q26) nebo t(3;3)(q21;q26) indukují nadměrnou expresi transkripčního faktoru EVI-1.
• Ztráta funkce v důsledku delece různé velikosti v genomových oblastech obsahujících geny s rolí v diferenciaci, apoptóze nebo buněčné proliferaci (např. IKZF1, PAX5…)

Kromě karyotypu, který umožňuje mít globální pohled na genom; FISH, cílená technika, se používá ke zvýraznění neviditelných abnormalit na karyotypu (kryptické abnormality) nebo času selhání karyotypu. Konvenční a molekulární cytogenetické techniky však nezdůrazňují žádné abnormality (např. různí partneři podílející se na tvorbě fúzních genů, zejména pro přeuspořádání genů MLL, mutace), a proto se zajímáme o sekvenování nové generace. RNA-seq) má tu výhodu, že umožňuje identifikaci různých typů mutací v jediném testu, s výjimkou epigenetických mutací. Důležitost sekvenování RNA spíše než genomické DNA je na jedné straně velmi významný pokles objemu sekvencí k analýze, protože transkribované geny mRNA představují asi 5 % velikosti genomu, a za druhé, lepší identifikace chimérických genů. RNA-seq se používá jako výzkumný nástroj u hematologických malignit. Účelem tohoto projektu je pomocí inovativní technologie vyvinout nový diagnostický a prognostický nový nástroj u hematologických malignit. Bude testováno 50 akutních leukémií a výsledky budou analyzovány podle tří kritérií:

• Množství, kvalita a relevance informací poskytovaných pro diagnostiku, monitorování a terapeutické řízení ve srovnání s konvenční strategií
• Období potřebné k získání výsledků a metody ke zkrácení doby analýzy tak, aby výsledky mohly být integrovány do terapeutických rozhodnutí.
• Ekonomické hodnocení, které vypočítá náklady na tuto možnost diagnózy a posoudí poměr nákladů a přínosů V budoucnu budou implementovány další inovativní přístupy (studium nerovnováh genomických abnormalit pomocí array-CGH, ​​analýza transkriptomu pomocí micro-array a studie methylomu ) identifikovat "molekulární podpis" každé leukémie a soubor informativních abnormalit pro diagnostiku, prognózu a léčbu onemocnění a sledování reziduální choroby.