Efficacia clinica del gel piastrinico da sangue cordonale per il trattamento delle ulcere del piede diabetico (CBPG-DFU)

Informazioni di base e fondamento logico dello studio: Evidenza n. 1 (gel piastrinico). Il gel ottenuto dall'attivazione piastrinica del plasma ricco di piastrine con trombina o con estratti farmaceutici di veleno di cobra è un emocomponente utilizzato per scopi clinici da diversi anni. Il razionale a sostegno di questa terapia si riferisce all'elevato contenuto di fattori di crescita nei granuli alfa piastrinici che possono essere somministrati per via topica da un trasportatore naturale biocompatibile (cioè le piastrine) dopo l'attivazione piastrinica. Finora, il gel piastrinico è stato utilizzato principalmente per riparare le ulcere cutanee recalcitranti in pazienti diabetici e non diabetici in un contesto di donazione di sangue autologo. Purtroppo, la maggior parte dei candidati a questa terapia sono pazienti anziani, spesso affetti da una serie di condizioni patologiche e comorbilità che li rendono per lo più inadatti o non idonei al processo di prelievo di sangue autologo. In pratica, la maggior parte dei pazienti che potrebbero beneficiare maggiormente di questa terapia sono di fatto privati ​​di un trattamento potenzialmente efficace a causa di questa limitazione.

Prova n. 2 (sicurezza trasfusionale). Gli attuali sistemi per lo screening dei donatori di sangue mediante test dell'acido nucleico virale hanno drasticamente ridotto il rischio di trasmissione di condizioni infettive attraverso la trasfusione di sangue e componenti del sangue. Di conseguenza, le limitazioni all'uso del sangue allogenico e degli emocomponenti che erano obbligatori alcuni decenni fa non trovano oggi giustificazione. Questo apre la prospettiva di un maggiore utilizzo di emocomponenti allogenici - incluso il gel piastrinico - con potenziali vantaggi per un gran numero di pazienti nei quali sono maggiormente indicati.

Prova n. 3 (gel piastrinico da sangue cordonale). Un gruppo di ricerca guidato dal ricercatore proponente il presente progetto ha recentemente sviluppato un nuovo metodo (PCT n. WO 2010/007502 A2, 21 gennaio 2010) per ottenere gel piastrinico dal sangue del neonato rimasto nella placenta dopo il parto, noto anche come sangue del cordone ombelicale o sangue placentare. I principali vantaggi finora individuati nel gel piastrinico derivato da piastrine del cordone ombelicale rispetto al gel piastrinico derivato da piastrine adulte riguardano l'assenza di contaminazione microbiologica nel primo e un diverso profilo delle concentrazioni dei fattori di crescita, la principale differenza consiste in una maggiore contenuto di VEGF e contenuto inferiore di TGF nel gel piastrinico del cordone ombelicale. Recenti modifiche apportate hanno portato a una procedura in cui il gel piastrinico da sangue cordonale può essere preparato e conservato in un piccolo sacchetto di plastica piuttosto che in provette o piastre, che possono essere facilmente criopreservate, conservate, trasportate in siti di uso clinico e applicate al ulcera cutanea senza interrompere la catena della sterilità. Ciò apre la strada a un uso più ampio del gel piastrinico allogenico del sangue del cordone ombelicale all'interno e all'esterno degli ospedali.

Prova n. 4 (lacune di conoscenza). Nonostante i risultati interessanti e promettenti sul gel piastrinico del sangue cordonale allogenico, mancano tre elementi prima che quest'ultimo possa essere ampiamente utilizzato in pazienti che potrebbero averne bisogno: (1) una caratterizzazione biochimica più completa; (2) un programma regionale o nazionale per raccogliere e preparare le dosi necessarie di gel piastrinico del sangue del cordone ombelicale; (3) uno studio clinico randomizzato di potenza statistica sufficiente per rilevare vantaggi significativi (sia clinici che economici) nei pazienti trattati con gel piastrinico del sangue del cordone ombelicale rispetto ai controlli trattati con farmaci avanzati per l'ulcera cutanea. A questo proposito, indagini su piccola scala suggeriscono che l'uso efficace del gel piastrinico può ridurre i costi dei farmaci per le ulcere cutanee recalcitranti a un decimo dei costi attualmente rimborsati agli ospedali per farmaci avanzati inefficaci (da circa 190.000 euro a circa 19.000 euro per il trattamento di 11 pazienti anziani) .

Prova n. 5 (banca del sangue cordonale e trapianto). Il sangue del cordone ombelicale - un tempo smaltito come rifiuto ospedaliero - è oggi una preziosa fonte di cellule staminali emopoietiche da utilizzare per la sostituzione del midollo osseo in pazienti affetti da gravi malattie del sangue. Gli ultimi 25 anni di esperienza clinica con questa fonte di cellule staminali hanno dimostrato che un'elevata dose cellulare e una migliore corrispondenza HLA sono i fattori più importanti che incidono sulla sopravvivenza del paziente. Per questo motivo, le banche del sangue cordonale crioconservano preferenzialmente unità di sangue cordonale con volumi molto grandi, poiché il volume è correlato al contenuto cellulare, e scartano circa tre quarti delle unità raccolte. Si prevede che il tasso di scarto aumenterà in futuro, anche perché l'inventario mondiale di circa 600.000 unità di sangue cordonale in 128 banche di sangue cordonale comprende già unità con volumi attualmente considerati non ottimali per il trapianto emopoietico. Si prevede quindi che il 70-80% delle unità di sangue cordonale donate per il trapianto emopoietico allogenico possano essere inadatte a questo uso e alla fine scartate. Queste unità possono essere utilizzate per la preparazione del gel piastrinico se viene sviluppato un programma adeguato di recupero dalle sale parto, trasporto a un sito di produzione e trasformazione in gel piastrinico.

Disegno dello studio: questo studio è uno studio clinico randomizzato controllato multicentrico (gel allogenico di piastrine nel sangue del cordone ombelicale (CBPG) vs farmaci locali standard (SLM)). Ogni centro clinico è stato invitato ad arruolare 15 pazienti trattati e 15 pazienti di controllo, in base alla disponibilità locale nell'intervallo di studio di 12 mesi.

Calcolo della dimensione del campione: 95 + 5 (dropout) test e 95 + 5 (dropout) pazienti di controllo assicurano l'80% di potenza per rilevare come statisticamente significativo (p<0,05) >60% di guarigione nel test vs 40% di guarigione nei controlli (Pocock, 1983).

Principi dell'analisi statistica: Statistica descrittiva: tabelle riassuntive per gruppo di trattamento (ad eccezione delle caratteristiche basali che verranno fornite per sequenza e complessive) secondo il tipo di variabile riassunta; criteri quantitativi: statistiche quantitative standard (N, media, DS, mediana, min-max); criteri qualitativi: distribuzione di frequenza [numero di osservazioni non mancanti (N) e percentuali (%)].

Preparazione del CBPG e controllo di qualità: le unità di CB sono raccolte di routine dopo il consenso informato della madre in sacchetti di plastica contenenti 21-29 mL di anticoagulante citrato-fosfato-destrosio (CPD) da ostetriche addestrate, rispettivamente prima e dopo il parto della placenta nei parti naturali e nei tagli cesarei , secondo procedure operative standard validate localmente, in banche pubbliche accreditate del sangue cordonale appartenenti alla Rete Italiana Sangue Cordonale coordinata dal Centro Nazionale Sangue. Dopo lo stoccaggio e il trasporto a temperatura ambiente monitorata, le unità saranno processate per la preparazione di CBPG entro 48 ore dalla raccolta. Sulla base di un precedente esercizio di standardizzazione, le banche partecipanti potranno utilizzare sacche disponibili localmente di dimensioni convenienti e volume nominale che ritengono appropriate per questo protocollo. Nel suddetto esercizio di standardizzazione, si è deciso di definire le caratteristiche principali del CBPC finale come segue: volume medio target 10 ml, range 5-15; concentrazione piastrinica media target 1 x 109/L, range 0,8 - 1,2 x 109/L. Quest'ultima concentrazione è stata scelta in accordo con la concentrazione piastrinica definita dalla Società Italiana di Medicina Trasfusionale per il gel piastrinico ottenuto da sangue adulto. Il CBPG sarà preparato secondo le procedure definite durante gli studi pilota presso ciascuna banca, che includevano una centrifugazione iniziale di CB a 200-210 g x 10-15 minuti, seguita dal trasferimento del plasma ricco di piastrine (PRP) in una sacca secondaria, centrifugazione del PRP a 1800-2600 g x 15 minuti e rimozione del plasma povero di piastrine supernatante (PPP) in eccesso rispetto al volume target finale del CBPC. Quest'ultimo è stato definito da un algoritmo automatizzato eseguito da un foglio di calcolo Excel utilizzato per la raccolta dei dati, che tiene conto della concentrazione piastrinica nel PRP e dei valori minimo (0,8 x 109/L) e massimo (1,2 x 109/L) del concentrazione piastrinica mirata nel CBPC finale. Le concentrazioni piastriniche nel PRP divise per 0,8 e per 1,2 x 109/L forniscono rispettivamente i limiti superiore e inferiore del volume CBPC. Il volume finale è stato stabilito determinando il peso netto del CBPC su una bilancia elettronica. Le unità di CBPC saranno infine criopreservate in un congelatore meccanico a -80 °C in vista dell'utilizzo clinico del CBPG, che richiederà lo scongelamento a 37°C in bagnomaria e l'attivazione con Calcio gluconato. Per i farmaci locali standard, ogni centro clinico utilizzerà i propri farmaci locali standard convalidati. I dettagli e le specifiche delle procedure mediche standard locali saranno raccolti da ciascun centro partecipante.

Trattamenti: Trattamenti di prova: il CBPG è un gel formato da frammenti di piastrine che intrappolano la fibrina da circa 10 miliardi di piastrine in 10 mL di plasma neonatale anticoagulato con CPD. Viene conservato in una busta in PVC commerciale per la preparazione e la conservazione dei componenti del sangue.

Negli anni '80 David Knighton sviluppò una tecnica per la stimolazione in vitro delle piastrine, con soluzioni di trombina che consentivano di raccogliere un supernatante abbondante di fattori di crescita. Questo prodotto, derivato dalle piastrine del paziente, è stato applicato localmente come gel per favorire la riparazione dell'ulcera.

Il razionale nell'utilizzo di tale prodotto è in presenza di diversi fattori di crescita tissutale: P.D.G.F. (fattore di crescita derivato dalle piastrine); E.G.F. (fattore di crescita epidermico); T.G.F. (Fattore di crescita trasformante); V.E.G.F. (Fattore di Crescita Endoteliale Vascolare); I.G.F. 1 e 2 (fattore di crescita insulinico 1 e 2); F.G.F. (fattore di crescita dei fibroblasti). Applicando in situ le piastrine iperconcentrate e attivate come gel piastrinico, vengono avviati e accelerati i processi di rigenerazione tissutale. In questo contesto, le piastrine sono simili a serbatoi cellulari di laboratorio che processano, immagazzinano e poi rilasciano (se attivati) diversi fattori di crescita in grado di stimolare la rigenerazione delle cellule staminali mesenchimali come fibroblasti, osteoblasti e cellule endoteliali. Questa capacità delle piastrine di prendere parte ai meccanismi di riparazione dei tessuti è stato il requisito teorico essenziale per utilizzare il gel piastrinico in diverse circostanze, tutte associate al requisito dell'attivazione della riparazione dei tessuti.

Le applicazioni ripetute di PG si sono dimostrate utili prima della chirurgia della ferita poiché possono ridurre le dimensioni della lesione, migliorare le condizioni anatomiche e morfologiche del letto e dei margini della ferita e innescare la neo-angiogenesi ai margini e all'interno dell'area necrotica.

La fonte abituale delle frazioni piastriniche è il sangue umano adulto, ma questa fonte comporta notevoli inconvenienti e problemi. Il sangue periferico di un essere umano non può essere utilizzato senza potenziali rischi dovuti all'alloreattività, con conseguenti diverse complicazioni cliniche. D'altra parte, la disponibilità di sangue autologo è generalmente bassa, poiché può essere pericoloso prelevare una quantità sufficiente da un paziente che non può tollerare tale prelievo. Inoltre, il sangue allogenico proveniente da donatori adulti può comportare rischi di infezione.

Le frazioni piastriniche derivate dal sangue placentare umano possono evitare gli inconvenienti di cui sopra e contengono anche alte concentrazioni di fattori piastrinici.

Dosaggio e somministrazione: per la medicazione dei pazienti arruolati nel braccio di trattamento, verrà somministrata un'unità CBPG (volume medio 10 ml, range 5-15; concentrazione piastrinica media 1 x 109/L (0,8 - 1,2 x 109/L) ogni 3-4 giorni. Le unità CBPG, criopreservate e conservate in un piccolo sacchetto di plastica in un congelatore a -80°C, saranno scongelate a 37°C in un bagno d'acqua e attivate con gluconato di calcio e immediatamente trasportate nei siti di uso clinico e applicate all'ulcera cutanea senza rompersi la catena della sterilità.

Valutazione dell'efficacia: l'efficacia sarà valutata con il modulo di ricerca clinica CBPG-DFU.

Valutazioni sulla sicurezza: verranno raccolte informazioni su tutti gli eventi avversi e sugli eventi associati al CBPG che si verificheranno durante il trattamento. Gli sforzi di cura e gestione forniti ad ogni visita di trattamento includeranno la pulizia e la valutazione della ferita e l'ottenimento di segni vitali e una storia provvisoria della ferita, comprese le informazioni relative a eventi avversi, farmaci concomitanti, nutrizione e stato di carico.