Robusta risposta di anticorpi e citochine al vaccino contro l'epatite B tra i pazienti non in trattamento con epatite C cronica: uno studio di controllo in aperto in Cina

Disegno dello studio e partecipanti Lo studio è stato condotto in tre contee (Yucheng, Xintai e Dongchangfu) della provincia di Shandong, in Cina, che presentavano il maggior numero di casi di HCV segnalati nella provincia. I potenziali pazienti con infezione cronica da HCV sono stati reclutati controllando le cartelle cliniche degli ospedali o chiedendo ai medici del villaggio. Gli individui sani sono stati selezionati casualmente da 3 a 5 volte i potenziali pazienti con infezione da HCV nella stessa contea. È stata effettuata un'indagine del questionario e sono stati raccolti campioni di sangue per ogni potenziale paziente e individuo sano allo stesso modo.

Sondaggio con questionario Abbiamo condotto un sondaggio basato su questionario per raccogliere le informazioni di base dei partecipanti, comprese le informazioni demografiche (età, sesso, altezza e peso), anamnesi (allergie, diagnosi e trattamento dell'epatite cronica C, vaccinazione, febbre e altre malattie acute) e stato comportamentale (fumo, alcol, gravidanza e allattamento).

Vaccinazione contro l'epatite B e follow-up Sono state somministrate tre dosi di vaccino contro l'epatite B prodotto mediante tecniche di DNA ricombinante in Saccharomyces Cerevisiae (20 μg HBsAg/1,0 ml per dose, Shenzhen Kangtai Biological Products Co., Ltd., Shenzhen, provincia del Guangdong, Cina) per via intramuscolare nella regione deltoidea a tutti i partecipanti rispettivamente a 0, 1 e 6 mesi. I campioni di sangue dei partecipanti sono stati raccolti un mese dopo la prima e la terza dose di vaccinazione.

Test di laboratorio ed esame fisico Test di screening ed esame fisico HBsAg, anti-HBs, HBeAg, anti-HBe, anti-HBc, anti-HCV e HCV RNA sono stati dosati per tutti i soggetti durante le visite di inclusione; bilirubina sierica, albumina sierica, tempo di protrombina, ALT plasmatica e aspartato aminotransferasi (AST) sono stati rilevati per il gruppo HCV. HBsAg, anti-HBs, HBeAg, anti-HBe e anti-HBc sono stati analizzati mediante Abbott Chemiluminesent Microparticle ImmunoAssay (CMIA) (Abbott Ireland Diagnostics Division, Sligo, Irlanda). L'anti-HCV è stato misurato mediante ELISA con un kit commerciale (prodotti Intec, INC, Xiamen, Cina). L'RNA dell'HCV è stato misurato mediante PCR quantitativa in tempo reale con kit disponibili in commercio (QIAGEN, Shenzhen, Cina). La bilirubina sierica, l'albumina, il tempo di protrombina, l'ALT plasmatica e l'AST sono state misurate utilizzando reagenti e metodi standard. Al fine di valutare l'attività della malattia, ogni paziente con infezione da HCV è stato sottoposto a esame clinico, compreso l'interrogatorio, l'esame obiettivo e l'ecografia.

Test anti-HBs dopo la vaccinazione L'anti-HBs è stato rilevato mediante CMIA (Abbott Ireland Diagnostics Division, Sligo, Irlanda) un mese dopo la prima e la terza dose di vaccinazione. Sebbene senza marcatori sierologici di HBV, i soggetti sono stati definiti come aventi una storia di infezione da HBV o vaccinazione contro l'epatite B se anti-HBs ≥100 mIU/ml un mese dopo la prima dose di vaccinazione.

Saggio CMI Prima della prima dose di vaccinazione e un mese dopo la terza dose di vaccinazione, 43 soggetti del gruppo HCV e 37 soggetti del gruppo di controllo sano sono stati selezionati in modo casuale rispettivamente per isolare le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) e testare la funzione CMI, compreso l'interferone -γ (IFN-γ), interleuchina-2 (IL-2), interleuchina-4 (IL-4), interleuchina-5 (IL-5) e interleuchina-6 (IL-6). Il polipeptide S28-39, il polipeptide MHC di classe I, il polipeptide MHC di classe II e l'HBsAg sono stati usati rispettivamente come stimolanti immunologici cellulari di IFN-γ. L'antigene di superficie del virus dell'epatite B è stato utilizzato come stimolante immunologico cellulare di IL-2, IL-4, IL-5 e IL-6. Il polipeptide S28-39, le miscele di polipeptidi MHC di classe I e le miscele di polipeptidi MHC di classe II sono state sintetizzate in BO MAI JIE Technology Co. LTD. (Pechino, Cina). HBsAg è stato fornito da Shenzhen Kangtai Biological Products Co., Ltd. (Shenzhen, Cina).

Le PBMC separate dal sangue anticoagulato con EDTA sono state regolate alla concentrazione di 2 × 106 cellule/mL. 100 μL 2 × 106 cellule/mL di PBMC sono stati aggiunti nelle piastre a 96 pozzetti PVDF pre-rivestite e 100 μL di peptide HBsAg S28-39 (IPQSLDSWWTSL, concentrazione finale: 10 μg/mL), 100 μL di miscele di polipeptidi di classe I MHC, 100 μL di miscela di polipeptidi MHC di classe II o 100 μL di HBsAg (80μg/mL) in ciascun pozzetto. Per quanto riguarda IL-2, IL-4, IL-5 e IL-6, le piastre sono state riempite con 100 μL 2 × 106 cellule/mL di PBMC e 100 μL di HBsAg (80 μg/mL) in ciascun pozzetto. Quindi sono stati incubati a 37 ° C, in un incubatore di CO2 al 5% e umidificato per 20 ore (IFN-γ, IL-2) o 40 ore (IL-4, IL-5 e IL-6). Dopo l'incubazione, le piastre sono state manipolate secondo il manuale di istruzioni del kit R&D ELISPOT (R&D Systems, Inc.). Le cellule che formano punti (SFC) sono state enumerate con il sistema ImmunoSpotTM (Cellular Technology Ltd.).

Valutazione della sicurezza Ai partecipanti sono state fornite schede di diario per registrare l'occorrenza e la gravità delle reazioni locali sollecitate nel sito di iniezione (dolore, indurimento, eritema, edema, prurito) durante i 7 giorni successivi alla vaccinazione, reazioni sistemiche sollecitate (febbre, cefalea, affaticamento, tosse , mialgia, astenia, vertigini, diarrea) e qualsiasi evento avverso non richiesto nei 29 giorni successivi alla vaccinazione.

Analisi statistiche L'inserimento dei dati e la gestione del database sono stati eseguiti rispettivamente da EPIDATA 3.0 e Microsoft excel 2010. L'analisi dei dati è stata eseguita da Stata 11.0. Le differenze tra il gruppo HCV e il gruppo di controllo sano nelle variabili continue e categoriche sono state esaminate utilizzando la regressione logistica condizionata. I sottogruppi di non-responder e low-responder rispetto a quelli normali e high-responder sono stati valutati in relazione alle caratteristiche demografiche, agli indicatori biochimici, agli stati delle malattie epatiche e all'RNA dell'HCV. Un test t di Student o ANOVA unidirezionale sono stati utilizzati per confrontare il titolo medio di anti-HBs tra diversi sottogruppi. Il test esatto di Fisher è stato utilizzato per confrontare i tassi di risposta. Il test non parametrico è stato utilizzato per confrontare i punti di immunodotting. L'analisi di correlazione del rango di Sperman è stata utilizzata per valutare la correlazione tra macchie di immunodotting e anti-HBs. Per tutti questi confronti, un P <0,05 bilaterale è considerato statisticamente significativo.