Probiotici nella sindrome dell'intestino corto

1. Introduzione e scopo: l'obiettivo di questo progetto è migliorare la crescita lineare e l'aumento di peso nei bambini con sindrome dell'intestino corto modificando il loro microbiota intestinale e, infine, il metabolismo batterico intestinale.

2. Sfondo: La sindrome dell'intestino corto (SBS) si verifica quando la massa intestinale è insufficiente per supportare la crescita e lo sviluppo normali. Circa 35 bambini su 100.000 nati vivi sono affetti da SBS in Nord America e questi bambini rimangono dipendenti dalla nutrizione parenterale endovenosa (PN) per un periodo di tempo prolungato. Una delle principali sfide che questi bambini devono affrontare è raggiungere una crescita lineare sufficiente e un aumento di peso nonostante ricevano calorie in eccesso rispetto a quelle richieste dai bambini sani della stessa età. Problemi con scarso assorbimento e motilità intestinale e aumento dell'infiammazione contribuiscono tutti alla scarsa crescita in questi pazienti. Un fattore importante per la sana funzione dell'intestino tenue rimanente è la comunità microbica intestinale. È noto che l'esaurimento di alcuni gruppi di batteri intestinali benefici e dei loro sottoprodotti metabolici, in particolare gli acidi grassi a catena corta (SCFA), può portare a infiammazione intestinale, malassorbimento e uso meno efficiente delle calorie consumate.

   L'obiettivo a lungo termine dello studio è determinare come modificare efficacemente il microbiota intestinale nei bambini con SBS per ripristinare un sano equilibrio e massimizzare la crescita e lo sviluppo. Sebbene i bambini con SBS abbiano disturbi noti al loro microbiota intestinale, non è chiaro se fornire un probiotico orale sia un approccio efficace per correggere questi disturbi.

   Obiettivo 1: Determinare se l'integrazione di probiotici può modulare significativamente il microbiota intestinale e migliorare la crescita nei pazienti con SBS.

   Obiettivo 2: Determinare i livelli di SCFA fecali nei bambini con SBS, compresi quelli che ricevono probiotici.

3. Descrizione dello studio: tutti i bambini idonei saranno acconsentiti al momento di una visita clinica ambulatoriale o durante una degenza ospedaliera. I partecipanti iscritti verranno quindi randomizzati al "placebo" dove riceveranno il trattamento medico e nutrizionale standard per la sindrome dell'intestino corto oltre a 1 ml di olio MCT puro (trigliceridi a catena media) al giorno per 3 mesi, o "terapia probiotica" dove riceveranno una combinazione di Lactobacillus rhamnosus (5 miliardi di unità formanti colonie al giorno) e Lactobacillus johnsonii (200 milioni di unità formanti colonie al giorno) al giorno per 3 mesi in aggiunta allo standard di cura. La randomizzazione non sarà in cieco. I probiotici sono stati scelti perché sono stati ben studiati nei neonati e nei bambini ed entrambe queste specie sono risultate carenti nei bambini con SBS e scarsa crescita. Il placebo è stato scelto perché è l'unico ingrediente inattivo incluso nella sospensione del probiotico, è inodore e insapore e non ha effetti collaterali noti. Il probiotico e l'olio MCT verranno somministrati giornalmente per via orale o attraverso un tubo gastrostomico esistente. I pazienti che abbandonano lo studio o che vengono ritirati non saranno sostituiti e i dati di questi soggetti saranno inclusi come parte dell'analisi in modalità intent-to-treat.

Le feci (circa 200 mg per campione) saranno raccolte in 3 punti temporali separati per ciascun paziente (all'inizio, a metà e alla fine dello studio). Le feci verranno raccolte durante una degenza ospedaliera o durante una visita clinica ambulatoriale. Se un paziente non è in grado di fornire un campione di feci, la famiglia può ritirarne uno a casa e può essere congelato e portato al momento della successiva visita clinica. Un campione congelato può essere utilizzato per il sequenziamento dell'rRNA 16S e l'analisi metabolomica, ma non per la concentrazione di SCFA. Il gDNA microbico può essere recuperato dalle feci che sono state congelate per un massimo di 6 mesi, con risultati di sequenziamento simili rispetto alle feci appena processate. Se viene fornito un campione fresco, una parte verrà utilizzata per determinare la concentrazione di SCFA. Le feci utilizzate per il sequenziamento dell'rRNA 16S e la metabolomica saranno mantenute congelate fino all'esecuzione dell'analisi. Verrà inoltre ottenuta una raccolta di feci una tantum da 10 pazienti di controllo con sindrome dell'intestino corto che stanno crescendo bene e verrà utilizzata per l'rRNA 16S e l'analisi metabolomica.

Le feci utilizzate per il sequenziamento del 16S rRNA saranno mantenute congelate fino al momento dell'analisi. Il gDNA batterico sarà quindi estratto dal contenuto fecale. Ampliconi dei geni batterici 16S rRNA saranno generati e sequenziati utilizzando Illumina Hi-Seq 2000 (UTSW Genomics Core). Le letture di sequenziamento saranno filtrate e la qualità ritagliata e analizzata utilizzando il pacchetto software QIIME.59 La diversità microbica sarà stimata calcolando l'indice di diversità di Shannon e l'indice di dissomiglianza di Bray-Curtis.

L'abbondanza batterica sarà determinata utilizzando curve standard costruite con riferimento al DNA batterico clonato corrispondente a un breve segmento del gene 16S rRNA che è stato amplificato da ceppi batterici di riferimento.63 Il Dr. Koh ha anche convalidato i protocolli qPCR per 6 gruppi batterici specifici: 1) Eubatteri (tutti i batteri); 2) Lactobacillus (un sottoinsieme di firmicutes); 3) Bacteroides (un sottoinsieme di Bacteroidetes); 4) Enterobacteriaceae (ENTERO; gram-negativi proinfiammatori come E.coli, Klebsiella spp, etc); 5) CLEPT (un sottogruppo di Firmicutes; Clostridi antinfiammatori produttori di butirrato); 6) EREC (un sottogruppo di Firmicutes; clostridi antinfiammatori produttori di butirrato). La qPCR specifica del gruppo batterico fornisce la quantificazione dell'abbondanza complessiva di gruppi specifici di batteri

Le concentrazioni di SCFA nelle feci saranno misurate in tutti i momenti in cui può essere fornito un nuovo campione. In breve, i campioni fecali freschi saranno pesati, sospesi in acqua con acido fosforico allo 0.5% e poi congelati immediatamente con azoto liquido. Data la volatilità degli SCFA, il congelamento rapido fornirà misurazioni più accurate. Le sospensioni fecali verranno quindi scongelate, omogeneizzate ed estratte con acetato di etile. Gli estratti organici saranno addizionati con standard SCFA marcati con carbonio (per quantificare accuratamente i livelli di SCFA) e processati su GC-MS.

Randomizzazione: i pazienti arruolati saranno randomizzati utilizzando un processo centralizzato basato su una tabella casuale. La randomizzazione sarà determinata chiamando un numero di telefono centrale del progetto a cui risponde l'infermiere ricercatore e richiedendo un ID soggetto e un'assegnazione al trattamento standard o alla chirurgia condizionale. Questo è uno studio in aperto e i pazienti saranno randomizzati in modo 1:1 a uno dei due bracci di trattamento.

Fase di trattamento:

I pazienti con placebo riceveranno il trattamento medico e nutrizionale standard per la sindrome dell'intestino corto oltre all'olio MCT quotidiano. Tutti i pazienti arruolati avranno una valutazione dettagliata della crescita durante lo studio. Le principali misure antropometriche della crescita includeranno peso, altezza, circonferenza della testa (per i bambini

Verranno inoltre raccolte informazioni cliniche dalle cartelle cliniche di tutti i pazienti arruolati, comprese informazioni su età, sesso, etnia, eziologia della SBS, qualità e frequenza dei movimenti intestinali giornalieri, uso di antibiotici nelle 4 settimane precedenti l'arruolamento e durante lo studio, infezioni durante lo studio, anamnesi chirurgica, comprese eventuali procedure di allungamento dell'intestino, lunghezza e anatomia dell'intestino tenue e del colon residui, presenza di uno stoma e/o di un tubo gastrostomico, anamnesi, farmaci, informazioni nutrizionali dettagliate (apporto calorico da parte nutrizione) e analisi del sangue nutrizionali di routine. Verrà eseguita un'analisi di regressione logistica graduale di queste caratteristiche cliniche per modellare i predittori indipendenti di scarsa crescita, utilizzando un livello di significatività di p

Probiotic Group - dove riceveranno una combinazione di Lactobacillus rhamnosus (5 miliardi di unità formanti colonie al giorno) e Lactobacillus johnsonii (200 milioni di unità formanti colonie al giorno) al giorno per 3 mesi in aggiunta allo standard di cura.

I campioni di feci saranno raccolti da entrambi i gruppi in 3 punti temporali separati per ciascun paziente, all'arruolamento iniziale, a metà e alla fine dello studio). I campioni verranno raccolti durante una visita clinica standard di cura, durante una degenza ospedaliera oa casa dall'assistente e congelati. Agli operatori sanitari verranno fornite istruzioni e kit per la raccolta delle feci.