Indagare sul ruolo dei biomarcatori nella previsione dell'esito per COVID 19

SCOPI

1. Determinare la prevalenza di un fenotipo "tempesta di citochine" iperinfiammatorio COVID-19 nei pazienti del Vancouver General Hospital
2. Determinare eventuali collegamenti potenziali tra tempesta di citochine e ARDS nei pazienti COVID-19
3. Profilare i pazienti con malattia lieve e grave nel tentativo di identificare i biomarcatori che potrebbero essere sviluppati in un test rapido per valutare i pazienti che richiedono cure urgenti da quelli che si riprenderanno da soli
4. Chiarire l'impatto della variazione genetica sugli esiti clinici di COVID-19
5. Identificare gli RNA rilevanti per SARS-CoV-2
6. Per determinare le differenze nei livelli fisiologici e di citochine prima e dopo che i pazienti sono trattati con terapie immunomodulatorie come parte dell'assistenza clinica nei pazienti COVID-19.

IPOTESI

1. Primario: sulla base di rapporti precedenti, circa il 50% dei pazienti COVID-19 dimostrerà un fenotipo di tempesta di citochine
2. Secondario: a) I pazienti che presentano una tempesta di citochine dimostreranno una maggiore incidenza di ARDS b) Identificheremo biomarcatori per test rapidi c) La variazione del gene dell'ospite influenzerà l'esito clinico dell'infezione da COVID-19

GIUSTIFICAZIONE

Il nuovo coronavirus umano del 2019, originariamente chiamato 2019-nCoV, e ora denominato sindrome respiratoria acuta grave coronavirus-2 (SARS-CoV-2), ha avuto origine a Wuhan, nella provincia di Hubei, in Cina, alla fine di dicembre 2019. Questo virus causa la malattia ora nota come COVID-19. Dopo la sua scoperta, SARS-CoV-2 ha avuto il sequenziamento del suo genoma e la determinazione del recettore di ingresso cellulare. La sua rapida diffusione globale e le prove della trasmissione comunitaria indicano una probabile influenza prolungata sul nostro sistema sanitario e sulla nostra economia. Ciò richiede una risposta coordinata da parte degli operatori sanitari e degli scienziati per discernere le strategie per il trattamento e la gestione terapeutica di COVID-19.

Al di fuori degli sforzi di sviluppo di vaccini e antivirali, l'attenzione su nuovi interventi terapeutici è stata relativamente minima, con pochi rapporti di studi clinici fino ad oggi, il che ha suscitato un invito all'azione per esplorare terapie dirette dall'ospite oltre ad altre strategie terapeutiche. Le descrizioni cliniche recentemente pubblicate di questa malattia hanno indicato che molti pazienti soffrono sia di uno stato iperinfiammatorio, denominato "tempesta di citochine" con conseguente morte spesso attribuibile allo sviluppo della sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS). Tuttavia, mentre la tempesta di citochine sembra associata alla gravità della malattia, devono ancora essere stabiliti collegamenti chiave tra la presenza di tempesta di citochine e lo sviluppo di ARDS, che è attualmente responsabile della maggior parte dei decessi per COVID-19. Delineazione di tale legame e accertamento clinico di un iper-infiammatorio (es. tempesta di citochine) fornirebbe la precedenza a specifici trattamenti antinfiammatori per ridurre l'incidenza di ARDS associata a COVID-19 e la mortalità poiché questo rimane attualmente dibattuto.

Analisi CyTOF: è uno strumento proteomico a singola cellula che verrà applicato utilizzando un pannello personalizzato di 31 anticorpi monoclonali che abbiamo sviluppato alla più ampia gamma possibile di cellule della linea sanguigna. McNagny ha sviluppato questa tecnologia come piattaforma per AllerGEN NCE (direttore scientifico associato di questo NCE). Identifica, con dettagli senza precedenti, sottoinsiemi rari di sangue maturo e cellule progenitrici. Include marcatori di cellule linfoidi innate (ILC) che svolgono ruoli potenti nell'innesco delle risposte immunitarie e anche progenitori delle cellule del sangue del midollo osseo. L'infiammazione cronica e l'infiammazione acuta grave portano entrambe a un rapido aumento della produzione di cellule infiammatorie e al rilascio prematuro di progenitori del midollo osseo. Il panel è stato validato internamente e ha mostrato utilità nell'identificare i pazienti adulti con malattia allergica cronica, una popolazione che sembra essere maggiormente colpita dalle infezioni respiratorie. Ci sarà l'obiettivo di profilare i pazienti con malattia lieve e grave nel tentativo di identificare biomarcatori che potrebbero essere sviluppati in un test rapido per valutare i pazienti che richiedono cure urgenti da quelli che si riprenderanno da soli.

Test genetici: gli autori hanno dimostrato che le differenze genetiche dell'ospite hanno un impatto significativo sugli esiti clinici della sepsi. Ad esempio, abbiamo dimostrato che una singola variante nucleotidica nel gene CETP raddoppia il rischio di mortalità a 28 giorni per sepsi. L'ipotesi è che, analogamente ad altre forme di malattia critica, la variazione del gene dell'ospite influenzerà anche l'esito clinico dell'infezione da COVID-19. Questo lavoro è progettato per chiarire l'impatto della variazione genetica sugli esiti clinici di COVID-19.

Test dell'RNA: le specie di RNA prive di cellule circolanti sono tipicamente incapsulate in vescicole extracellulari (EV) che le proteggono dalla degradazione nei fluidi corporei. È presente un'ampia varietà di biotipi di RNA circolante, con i micro RNA (miRNA) che rappresentano la classe più studiata. Questi e altri RNA circolanti possono partecipare alla comunicazione cellula-cellula, possono essere espressi in modo differenziato nei pazienti rispetto ai controlli e possono essere associati alla progressione della malattia, alla disseminazione o alle risposte ai farmaci in una varietà di indicazioni di terapia acuta e critica tra cui sepsi, neurotrauma e malattie cardiovascolari.

Le condizioni sono ottimizzate per ottenere dati affidabili e completi sull'RNA circolante da volumi di ingresso minimi di plasma o siero umano. Gli studi iniziali che hanno utilizzato 200 ul di siero hanno prodotto ~15 ng di RNA, superando chiaramente l'input minimo di 100 pg per generare librerie per il sequenziamento di nuova generazione. L'analisi pilota di 3 donatori volontari umani sani ha superato criteri di qualità superiori a 10 milioni di letture/campione e ha confermato che il 98% dei miRNA esosomiali è stato rilevato nelle firme totali di una media di 359 miRNA. È importante sottolineare che questo metodo fornisce anche dati sull'intero panorama trascrizionale di RNA circolanti potenzialmente informativi da volumi di campioni molto fattibili per gli studi clinici. Ulteriori studi di ottimizzazione utilizzando sia il siero che il plasma di un singolo donatore umano hanno dimostrato che è possibile ottenere dati sull'RNA di buona qualità a partire da un volume di input di appena 50 µl e che sono state trovate le distribuzioni attese del biotipo dell'RNA sia per il siero che per il plasma

OBIETTIVI

Comprendere meglio 1) i collegamenti tra tempesta di citochine e ARDS nei pazienti con COVID-19 2) il profilo dei biomarcatori dei pazienti con COVID-19 con malattia lieve e grave 3) l'impatto della variazione genetica sugli esiti clinici nei pazienti con COVID-19

PROGETTO DI RICERCA

Panoramica

I pazienti ricoverati nell'Unità di Terapia Intensiva (ICU) e nell'Unità di Alta Acuità (HAU) del Vancouver General Hospital (VGH) o del Surrey Memorial Hospital (SMH) con sospetto COVID-19 saranno messi in quarantena in un'unità di isolamento. Qui, i campioni saranno raccolti per la conferma di laboratorio di SARS-CoV-2. L'assistenza clinica inizierà e sarà guidata dalla discrezione dei medici curanti in conformità con l'attuale procedura operativa di VGH/VCH per la gestione di COVID-19.

Una volta che l'assistenza clinica è iniziata, un campione di sangue sarà raccolto nei giorni 1-7, 10, 14 e 21 dopo il ricovero in ICU/HAU da parte del personale clinico in ICU/HAU in provette vacutainer con separatore di siero (SST, Vacutainer®, Becton & Dikinson). Questi campioni saranno analizzati per un pannello di citochine, marcatori infiammatori, CyTOF, RNA e test genetici. Le analisi saranno eseguite presso 1) il laboratorio della dott.ssa Cheryl Wellington presso il David Mowafaghian Center for Brain Health (UBC), 2) il laboratorio della dott.ssa Kelly McNagny, DMCBH, UBC., 3) il dott. Il laboratorio di Liam Brunham al Center for Heart Lung Innovation (HLI), St Paul's Hospital.

Verrà condotto uno studio di coorte nidificato per esaminare i cambiamenti nei giorni senza ventilazione, PaO2/FiO2 e citochine infiammatorie prima dopo la somministrazione di terapie immunomodulatorie che sono somministrate come parte dell'assistenza clinica di routine per la sindrome da tempesta di citochine.

ANALISI STATISTICA

L'attualità di questo focolaio di malattia rende difficile un solido test di potenza statistica. Tuttavia, digitalizzando i dati dal recente lavoro di Huang e del collega, che è uno dei numerosi rapporti che dimostrano la tempesta di citochine nei pazienti con COVID in condizioni critiche, un calcolo di esempio basato sul loro IL-1b, IL-2, IL-10 e TNF-α i dati sono forniti. I calcoli di potenza presentati di seguito si riferiscono al test Mann-Whitney-U non parametrico di campioni indipendenti e sono stati condotti in G*power (V3.1.9.1):

IL-1: questo non era significativamente diverso nel rapporto di Huang e colleghi (Huang et al., 2020).

IL-2: con la media stimata ± DS derivata da Huang e colleghi di 9,5 ± 4,3 e 6,7 ± 4,3 pg/mL di IL-2 in pazienti con COVID-19 in condizioni critiche rispetto a pazienti non in condizioni critiche, ~ 40 pazienti per gruppo (80 totale) sarebbe necessario per rilevare una differenza (potenza = 0,80, alfa = 0,05)

IL-6: questo non è stato misurato da Huang e colleghi (Huang et al., 2020), tuttavia, con un campione di 150 pazienti in totale, Ruan e colleghi sono stati in grado di rilevare differenze significative nei livelli di IL-6 (Ruan et al ., 2020).

IL-10: con la media stimata ± SD derivata da Huang e colleghi di 19,5 ± 39,6 e 5,3 ± 4,3 pg/mL di IL-10 in pazienti COVID-19 in condizioni critiche rispetto a pazienti non in condizioni critiche, sarebbero necessari circa 60 pazienti per gruppo (120 in totale) per rilevare una differenza (potenza = 0,80, alfa = 0,05).

TNF-α: con la media stimata ± DS derivata da Huang e colleghi di 93,2 ± 20,8 e 71,7 ± 21,4 pg/mL di TNF-α in pazienti COVID-19 in condizioni critiche rispetto a pazienti non in condizioni critiche, sarebbero necessari ~17 pazienti per gruppo (34 in totale) per rilevare una differenza (potenza = 0,80, alfa = 0,05)

Date le stime delle dimensioni del campione presentate sopra, che una marcata differenza nell'IL-6 è stata segnalata anche da Ruan e colleghi e il tasso di ricovero previsto dei pazienti COVID-19 nei prossimi mesi, miriamo a reclutare fino a 150 pazienti.

Una variazione di log2 volte >1 e un p value aggiustato <0.05 saranno usati come soglia di significatività per gli RNA regolati in modo differenziale. L'Ingenuity Pathway Analysis verrà utilizzata per identificare le reti causali, con un'ulteriore analisi fissata a una soglia di un valore log p negativo >20. Useremo i filtri Antimicrobial Response, Inflammatory Response e Infectious Disease per identificare gli RNA rilevanti per SARS-CoV-2. Le mappe di calore saranno generate mediante analisi di confronto.

Piano di analisi

Primario: Confronteremo i livelli di citochine tra i pazienti che sviluppano ARDS e quelli che non lo fanno. Utilizzeremo campioni t-test indipendenti nei dati normali (determinati tramite il test di Shapiro Wilks) o test Mann-Whitney-U se i dati non sono distribuiti normalmente.

Analisi a priori: valuteremo gli effetti di farmaci immunosoppressori o antivirali somministrati come parte della cura clinica degli esiti fisiologici e dei cambiamenti nei biomarcatori sierici.

Secondario: nelle analisi esplorative volte a soddisfare il nostro obiettivo secondario, utilizzeremo le nostre misure quotidiane di citochine per determinare se esistono soglie di citochine associate allo sviluppo di ARDS nei pazienti COVID-19.

Studio di coorte con corrispondenza nidificata:

1. Esaminare le differenze nei giorni liberi dal ventilatore nel tocilizumab (somministrato come parte dell'assistenza clinica) e nei gruppi di supporto utilizzando un t-test a due code per campioni indipendenti.
2. Esaminare le differenze negli esiti fisiologici cardiorespiratori (PaO2/FiO2, pressione arteriosa media e frequenza cardiaca) nel tocilizumab (somministrato come parte dell'assistenza clinica) e nei gruppi di supporto utilizzando campioni indipendenti t-test a due code.
3. Esaminare le differenze nelle citochine infiammatorie sieriche nel tocilizumab (somministrato come parte dell'assistenza clinica) e nei gruppi di supporto utilizzando campioni indipendenti t-test a due code.