L'impatto dell'inquinamento atmosferico sul consumo di antimicrobici nella popolazione generale (ONAIR)

Il progetto ONAIR sarà costituito dai due sotto-studi descritti di seguito:

SOTTOSTUDIO 1

1.1 Progettazione: un'analisi in due parti della serie temporale dell'associazione tra la concentrazione dei principali inquinanti atmosferici (PM2.5, PM10, NO2, O3) tra il 2006 e il 2022 e il consumo giornaliero di antimicrobici da parte della popolazione generale.

1.2 Ambito dello studio e fonti di informazione autorizzate: Lo studio sarà realizzato nelle 11 città della Catalogna con più di 100.000 abitanti, distribuite nelle quattro province della regione. Queste città ospitano 3.283.501 persone. I dati giornalieri sull'inquinamento atmosferico saranno ottenuti dalla rete di monitoraggio e previsione dell'inquinamento atmosferico (XVPCA). Il consumo giornaliero di antimicrobici sarà stimato dai dati di prescrizione ufficiali registrati dal Consiglio del Collegio dei Farmacisti della Catalogna (CCFC) autorizzato dal Dipartimento della Salute della Catalogna. Le variabili cliniche secondarie oggetto di studio saranno ottenute tramite l'Agenzia per la valutazione della qualità e della salute della Catalogna.

1.3 Materie di studio: Adulti e bambini residenti nelle 11 città oggetto di studio.

1.4 Definizioni: Inquinamento atmosferico. Questo è definito come il rilevamento di qualsiasi sostanza nell'aria che può danneggiare la salute di persone, animali o piante o causare danni materiali. L'inquinamento atmosferico proviene da diverse fonti; varia in funzione della sua composizione che, a sua volta, varia in funzione della temperatura e dell'umidità dell'ambiente. Ai fini di questo studio, poiché non tutte le stazioni di monitoraggio della qualità dell'aria registrano dati su tutti i composti, verranno analizzati PM10, PM2.5, NO2 e 03. DDD (dose giornaliera definita). È l'unità tecnica di misura e di confronto equivalente alla dose media giornaliera di mantenimento di un farmaco utilizzato nella sua indicazione principale per una determinata via di somministrazione negli adulti, espressa in termini di quantità di principio attivo. È definito e aggiornato dall'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) (https://www.whocc.no/ddd/definition_and_general_considera/#General). DDD/TID (dose giornaliera definita per mille abitanti al giorno). Questo parametro ha lo scopo di confrontare il consumo di droghe espresso in numero di DDD per diverse aree geografiche e/o periodi temporali. Si calcola moltiplicando il numero di DDD consumati per mille abitanti e dividendo per il numero di giorni nel periodo considerato e per il numero di abitanti. Formula DDD/TID = (nºP x NºF x AF x 1000) / (DDD x nº di abitanti x nº di giorni) (nºP = numero di confezioni erogate giornalmente. NºF = numero di forme farmaceutiche (es. pillole, capsule ecc.) per confezione. AP = quantità di principio attivo per forma farmaceutica). Denominatore della popolazione: per il calcolo del numero di abitanti verrà utilizzata la popolazione (utenti con tessera sanitaria individuale e assegnati a un centro di cura) in cura da ciascun medico, calcolata dai dati del sistema informativo delle cure primarie, comprendente anche l'infermieristica popolazione domestica.

1.5 Descrizione delle variabili: Principale variabile di esito: dose giornaliera definita di antimicrobici per 1000 abitanti al giorno. Principali variabili indipendenti: concentrazioni di PM10, PM2.5, NO2 e 03.

Variabili confondenti: anno, giorno della settimana, temperatura e umidità relativa.

Variabili di esito secondarie: costi giornalieri definiti degli antimicrobici per 1000 abitanti al giorno, mortalità per cause naturali, mortalità per cause respiratorie, ricoveri ospedalieri per cause respiratorie e visite di assistenza primaria per sintomi respiratori.

1.6 Raccolta dati: dati sull'inquinamento: i dati sull'inquinamento nelle 11 città oggetto di studio dal 2006 al 2020 saranno ottenuti dal XVPCA per l'analisi delle serie temporali. In ogni zona di qualità dell'aria possono essere individuate aree distinte in base all'uso del suolo (livello 1: aree urbane, suburbane o rurali) e al tipo di fonti di emissione (livello 2: traffico, industriale o di fondo).

Verranno registrate le serie temporali della temperatura media giornaliera e dell'umidità relativa dal 2006 al 2020, misurate dal Servizio meteorologico catalano. I dati giornalieri su inquinamento, temperatura e umidità in queste aree nel 2021 e nel 2022 saranno raccolti in modo prospettico. Anche il giorno della settimana e la serie temporale dei casi giornalieri di influenza saranno considerati variabili confondenti. Le associazioni di concentrazioni dei principali inquinanti, il consumo giornaliero di antimicrobici (DDD/TID) e le variabili secondarie descritte saranno valutate in analisi separate utilizzando un approccio di serie temporali standard, un protocollo analitico a due fasi che è stato ampiamente applicato in precedenti studi di serie temporali in molte città diverse. Dati sulla popolazione e sul consumo di antimicrobici. I dati saranno raccolti per età (> 65 anni), sesso e regione.

Per il calcolo del DDD/TID e del costo erogato/TID verranno raccolti i seguenti dati giornalieri per CAP: il farmaco (combinazione principio attivo + forma farmaceutica + dose + numero forme farmaceutiche per confezione), codice ATC, numero di confezioni erogate, data di erogazione e prezzo ufficiale di ciascuna confezione. Verrà registrato anche il numero di utenti con tessera sanitaria individuale e centro di cura assegnato.

1.7 Analisi statistica: nella prima fase, le associazioni tra la dose giornaliera di terapia antibiotica e gli inquinanti atmosferici valutati saranno stimate in ciascuna città utilizzando modelli lineari generalizzati quasi-Poisson. Come negli studi precedenti, nel modello principale saranno incluse le seguenti covariate: l'anno (smussato da spline cubiche) per controllare l'andamento e la stagionalità temporale degli indicatori; una variabile indicante il giorno della settimana per tener conto delle variazioni settimanali di breve termine; e la temperatura (smorzata da spline) e l'umidità relativa (smussata da spline) per controllare i potenziali effetti confondenti non lineari del tempo nelle aree in cui queste informazioni sono disponibili. Poiché il possibile effetto di un inquinante sulla dose giornaliera di antibiotico può essere proiettato nei giorni successivi, nei modelli stimati verrà esplorata una serie di intervalli temporali. Lo stesso procedimento sarà applicato alla temperatura. Nella seconda fase, un modello a effetti casuali verrà utilizzato per meta-analizzare le stime dell'associazione tra l'inquinante e il consumo giornaliero di antimicrobici ottenute in ciascuna città. Pertanto, si otterranno le stime aggregate e i relativi intervalli di confidenza al 95% della variazione percentuale del consumo giornaliero di antimicrobici per ogni aumento di 10μg/m3. Il test I² sarà utilizzato per valutare l'eterogeneità tra le città. Allo stesso modo, i modelli saranno stimati per valutare le associazioni tra variabili di risultato secondarie e inquinanti atmosferici. L'analisi statistica sarà effettuata utilizzando il pacchetto statistico R (versione 3.6.1 o successiva (R Foundation for Statistical Computing) utilizzando mgcv per i modelli principali e rmeta per il modello a effetti casuali. La significatività statistica sarà considerata per p <0,05.

1.8 Limitazioni: Una possibile limitazione può essere la difficoltà nel distinguere tra l'impatto dell'inquinamento sul consumo di antibiotici come relazione causa-effetto diretta o come fattore di confusione nella relazione causa-effetto tra inquinamento atmosferico e riacutizzazioni respiratorie di patologie pregresse.

SOTTOSTUDIO 2

2.1 Disegno: Studio osservazionale descrittivo della concentrazione di geni di resistenza agli antibiotici (ARG) nell'area di Barcellona durante il periodo 2021-2023. Verranno valutate le differenze tra la concentrazione di questi geni in una stazione di monitoraggio della qualità dell'aria vicino a un ospedale e in un'altra stazione in altre parti della città, così come le differenze interstagionali e intermensili. La presenza di determinati geni di resistenza sarà valutata in relazione al consumo di determinati gruppi di antimicrobici nella popolazione in studio.

2.2 Ambito dello studio e fonti di informazione: Lo studio sarà condotto nella città di Barcellona. I campioni di inquinamento atmosferico saranno ottenuti per l'analisi da tre delle stazioni di monitoraggio della qualità dell'aria del XVPCA: una nel centro della città dove c'è un volume di traffico significativo e l'altra situata vicino a un ospedale di terzo livello.

2.3 Materie di studio: Adulti e bambini residenti nella città di Barcellona.

2.4 Definizioni: ARG (gene della resistenza agli antibiotici): il frammento del genoma di un microrganismo che codifica i meccanismi di resistenza agli antimicrobici. I microrganismi possono acquisire ARG tramite ereditarietà o trasferimento orizzontale di geni da altri microrganismi. Inquinamento atmosferico: vedere la definizione nel sottoprogetto 1, sezione 1.4.

2.5 Variabili dello studio: Principale variabile di esito: concentrazione di geni di resistenza agli antibiotici/mese. Principale variabile indipendente: dose giornaliera definita di antimicrobici per 1000 abitanti al giorno.

2.6 Raccolta: Raccolta dei campioni: I campioni dei filtri utilizzati per misurare le concentrazioni di PM saranno raccolti in tre stazioni nella zona XVPCA 1, corrispondente alla città di Barcellona. I campioni saranno raccolti in due stazioni rappresentative dell'inquinamento da traffico urbano (Plaça Universitat e Poble Nou) e in un'altra stazione rappresentativa di un'area ospedaliera (Parc de Vall D'Hebron). Il prelievo avverrà il primo martedì di ogni mese. In questo modo verranno effettuate tre misurazioni mensili su un totale di 30 mesi, quindi verranno raccolti un totale di 90 campioni. Se si verifica un episodio di elevata contaminazione durante lo studio, verrà valutato un campionamento extra. Saranno inoltre registrati i dati meteorologici corrispondenti a ciascun giorno di misurazione.

Elaborazione del campione: i campioni saranno raccolti attraverso filtri in fibra di quarzo Pallflex ad alto volume (30 m3) (15 cm di diametro). Prima dell'uso, i filtri saranno sterilizzati a 205°C per 5 ore e condizionati per 48 ore a 20°C e 50% di umidità relativa. Ogni filtro verrà pesato tre volte ogni 24 ore in una microbilancia con sensibilità di 1 g. Dopo il campionamento, i filtri saranno portati al laboratorio di microbiologia dove verranno estratti i campioni di PM2.5, come segue. Per prima cosa il filtro verrà tagliato con un taglierino sterilizzato. Quindi, ciascun frammento del filtro verrà aggiunto a 2 ml di acqua purificata sterile con soluzione di Tween 20 allo 0,05% in una vasca da centrifuga sterile; quindi, verrà eseguita una sonicazione di 20 minuti seguita da 40 minuti di agitazione vortex a 2800 giri/min. I campioni di PM2.5 saranno conservati a -20ºC fino a quando non saranno processati definitivamente. Estrazione del DNA e sequenziamento shotgun del DNA microbico: dalla diluizione ottenuta, verrà estratto 1mg/mL. L'estrazione del DNA verrà eseguita automaticamente utilizzando l'apparecchiatura KingFisher (ThermoFisher) con il kit MagMaxTM Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation (ThermoFisher). Le librerie saranno costruite utilizzando il kit Illumina Nextera-XT®.

Il sequenziamento verrà eseguito 2x150 bp su NextSeq550® di Illumina. La qualità delle sequenze sarà analizzata con il programma FastQC1 e il corrispondente filtraggio sarà eseguito con il programma Trimmomatic2. La contaminazione umana sarà eliminata mappando le sequenze filtrate rispetto al genoma umano con il programma Bowtie 23. Il software Metaphlan v24 verrà utilizzato per dedurre la composizione microbica. Per studiare il resistoma, i geni di resistenza agli antibiotici acquisiti e le mutazioni puntiformi cromosomiche saranno identificate con ResFinder 3.05. Dati sulla popolazione e dati sul consumo di antimicrobici: questi dati saranno raccolti nello stesso modo descritto per il sottoprogetto 1 (vedi sezione), ma nell'area di Barcellona, ​​e in particolare nei codici postali corrispondenti alle aree in cui vengono raccolti i dati metagenomici.

2.7 Analisi statistica: saranno create mappe di calore per l'abbondanza relativa di ARG in base alle differenze di 2-ΔCT. Verrà eseguita un'analisi di rete basata sulle correlazioni di rango di Spearman per visualizzare la coincidenza dei sottotipi di ARG nell'aria e nelle comunità batteriche. Le concentrazioni di ARG in diversi mesi e stagioni saranno confrontate utilizzando boxplots. Inoltre, verrà effettuata una correlazione di Pearson per correlare la concentrazione di ARG al consumo di antimicrobici nelle aree oggetto di studio. Per valutare la ricchezza e la diversità della comunità batterica, la diversità alfa sarà calcolata utilizzando Mothur 1.30.1 in accordo con la letteratura (Schloss et al, 2009) per un livello di confidenza del 95%. L'analisi statistica sarà effettuata utilizzando il pacchetto statistico R versione 3.6.1 o successiva (R Foundation for Statistical Computing).

2.8 Limitazioni: la principale limitazione di questo sottostudio è la sua natura descrittiva. Il periodo di tempo oggetto di studio non consente di stabilire relazioni temporali dirette tra il grado di inquinamento atmosferico e la concentrazione di ARG in un determinato giorno. Inoltre, a causa della complessità della tecnica, è possibile eseguire solo un numero limitato di determinazioni ARG; pertanto, l'analisi della loro relazione con il consumo di antimicrobici da parte della popolazione dovrà essere descrittiva.

3. CONSIDERAZIONI ETICHE: Questo progetto di ricerca biomedica è stato valutato dal Comitato Etico della Ricerca dell'Ospedale Universitario di Bellvitge. Sarà realizzato secondo i precetti della Dichiarazione di Helsinki (Fortaleza, 2013). Saranno utilizzati dati clinici aggregati dal database del Dipartimento della Salute della Catalogna. Per questo motivo, l'obbligo del consenso informato è stato derogato dal Comitato Etico. Tuttavia, i dati saranno trattati in conformità con la normativa spagnola (Legge organica 3/2018) ed europea (Regolamento [UE) 2016/679).