Studio molecolare sull'identificazione della sepsi precoce (MESIS)

Contesto La sepsi è stata recentemente ridefinita (sepsi 3) come un'infezione che porta a disfunzione d'organo (1). Sebbene questa definizione non sia generalmente accettata da tutti i ricercatori (2,3) a causa del potenziale ritardo nella diagnosi, la mortalità correlata a questa entità potrebbe essere significativamente ridotta mediante l'adozione precoce di protocolli diagnostici e l'uso appropriato e precoce della terapia antimicrobica (ATB).

Un recente studio in Catalogna (4) ha mostrato un'incidenza di 212 casi di sepsi per 100.000 abitanti/anno con una mortalità ospedaliera del 21%, che è significativamente più alta se si considerano i pazienti in terapia intensiva (40%) o quelli affetti da shock settico (> 50%) (5,6). Questi dati evidenziano l'importanza attuale di questa entità ed evidenziano la necessità di ricercare nuove alternative per diagnosi e cure precoci e appropriate per avere un impatto favorevole sull'alto tasso di mortalità.

Il trattamento inefficace della sepsi è spesso dovuto alla diagnosi tardiva della sepsi, a causa della complicazione intrinseca dei segni clinici non specifici. Sebbene la procalcitonina (PCT) sembri essere un biomarcatore adeguato per la diagnosi di infezione batterica (7,8), diversi studi mostrano una discriminazione di solo circa l'80% (7,8) e recenti linee guida internazionali ne sconsigliano l'uso (9, 10,11). Queste stesse linee guida raccomandano l'uso di punteggi, come SOFA (valutazione sequenziale dell'insufficienza d'organo) e qSOFA (una versione semplificata) basata sulla presenza di coscienza alterata, ipotensione e tachipnea) per la stratificazione precoce del rischio di pazienti sospettati di infezione.

Tuttavia, le sindromi infiammatorie sistemiche sepsi e non sepsi si presentano come entità clinicamente simili ed entrambe sono spesso complicate dalla comparsa di disfunzione d'organo. Pertanto, l'identificazione della sepsi rimane soggettiva e può portare a una sovradiagnosi di sepsi e di conseguenza a un uso elevato di ATB in pazienti che non hanno sepsi e che non beneficiano di questo trattamento (12).

La disponibilità di nuove tecniche molecolari e l'automazione di queste analisi di laboratorio hanno stimolato la ricerca di biomarcatori correlati alla risposta dell'ospite alla sepsi. L'analisi dell'espressione genica dell'ospite attraverso trascrizioni di RNA (trascrittomica) offre un'opportunità in questo complesso contesto del paziente critico. L'espressione genica dell'ospite differisce notevolmente tra i pazienti settici e gli individui sani (13). Tuttavia, sebbene l'espressione genica tra pazienti infiammati settici e non settici si sovrapponga in larga misura, diverse differenze tra le trascrizioni osservate nella sepsi possono aiutare a distinguere l'infezione da altre cause di infiammazione [14]. Il test di trascrizione SeptiCyte™ LAB è stato sviluppato per diagnosticare l'infezione in pazienti critici con sospetta sepsi [15]. È il primo test di risposta dell'ospite basato su metodi quantitativi di PCR con trascrittasi inversa (qRT-PCR) ad essere approvato dalla Food and Drug Administration (FDA) statunitense. SeptiCyte™ LAB consente di valutare la risposta dell'ospite all'infezione misurando l'espressione di geni specifici coinvolti nella funzione immunitaria e nella segnalazione infiammatoria nel sangue intero. Il test consiste nell'amplificazione simultanea di 4 trascritti di RNA

1. molecola di adesione cellulare correlata all'antigene carcinoembrionale 4 (CEACAM4),
2. proteina di membrana associata al liposoma 1 (LAMP1),
3. proteina di adesione cellulare placenta-specifica 8 (PLAC8) e
4. fosfolipasi A2 gruppo VII (PLA2G7)

Il primo studio sulle prestazioni cliniche di SeptiCyte™ LAB ha analizzato 345 pazienti che sono stati arruolati come parte della coorte di diagnosi molecolare e stratificazione del rischio di sepsi (MARS) in due unità di terapia intensiva nei Paesi Bassi [15]. I pazienti sono stati classificati come affetti da sepsi sulla base di una valutazione medica post-hoc delle prove cliniche, radiologiche e microbiologiche disponibili [16] risultanti in stime per AUC (da 0,77 a 0,99), sensibilità (da 79% a 100%) e specificità ( dal 33% al 91%) variava ampiamente, a seconda della prevalenza della sepsi, del livello di confidenza rispetto alla diagnosi di riferimento e se la registrazione del paziente fosse consecutiva. In un sottogruppo post-hoc di 157 pazienti con dati completi, SeptiCyte™ LAB (AUC 0,88, 95% CI 0,81-0,93) ha superato la discriminazione PCT (AUC 0,84, IC 95% 0,76-0,92, p<0,001). Tuttavia, la migliore capacità discriminatoria è stata raggiunta da una combinazione di entrambi i biomarcatori (AUC 0,89, 95% CI 0,82-0,95, p<0,01). Poiché questa analisi ha richiesto circa 6 ore, è stato sviluppato uno strumento diagnostico precoce della sepsi (SeptiCyte RAPID (17)) che si basa sulla misurazione di due dei quattro biomarcatori di espressione genica nel sangue periferico (PLAC8 e PLA2G7) utilizzando lo stesso metodo quantitativo inverso reazione a catena della trascrizione della polimerasi (RT-qPCR) e si correla strettamente con i risultati clinici di SeptiCyte LAB, ma con un flusso di lavoro molto più semplice. Sulla base dei risultati, il dispositivo emette un rapporto con una scala di probabilità di sepsi. (vedi algoritmo allegato) Questa nuova metodologia di analisi, insieme ai consueti biomarcatori, può migliorare la diagnosi precoce della sepsi, differenziare tra pazienti infiammati e settici.

Il test FilmArray® per l'identificazione dell'emocoltura (BCID®) è un test molecolare approvato per l'identificazione diretta di BSI che causa agenti patogeni da BC positivi (18). Una versione recentemente aggiornata del pannello (BCID2®) comprende migliori caratteristiche di identificazione delle specie e consente il rilevamento di una β-lattamasi a spettro espanso (ESBL) e diversi geni che codificano per la carbapenemasi. Il pannello BCID2® analizza 43 bersagli associati a infezioni del flusso sanguigno, inclusi batteri gram-negativi, batteri gram-positivi, lieviti e 10 geni di resistenza antimicrobica, tutti con un solo test e con risultati disponibili in circa un'ora dall'emocoltura positiva. Inoltre, il menu del pannello BCID2® include sette geni di resistenza aggiuntivi, tra cui carbapenemasi, geni di resistenza alla colistina e un test MREJ che consente un'identificazione più specifica dell'MRSA. Uno studio recente (19) valuta le prestazioni cliniche del test BCID2 per l'identificazione delle specie in 180 emocolture (BC) positive. I risultati BCID2 erano concordanti con lo standard di cura (SOC) in 159/180 (88,3%) BC; Sono stati identificati rispettivamente 68/74 (91,9%) e 71/74 (96,0%) di tutti i campioni che coltivavano patogeni monobatterici, Gram-positivi o Gram-negativi, in accordo con i risultati SOC. La non concordanza era correlata al rilevamento di agenti patogeni aggiuntivi mediante il test BCID2 (n = 4), all'identificazione di specie discrepanti (n = 4) o all'incapacità di BCID2 di rilevare agenti patogeni sul pannello (n = 1).

La consueta implementazione del BCID2® viene eseguita una volta che l'emocoltura è positiva. Tuttavia, alcuni risultati preliminari (20) suggeriscono che le prestazioni di BCID2® nel rilevare i microrganismi molto presto, potrebbero essere adeguate con solo poche ore (6-8 ore) di incubazione dell'emocoltura e prima che l'emocoltura diventi positiva.

Poiché la diagnosi precoce e la somministrazione precoce di una terapia antibiotica efficace sono di fondamentale importanza per migliorare l'esito del paziente, lo scopo del presente studio è sviluppare e valutare un protocollo clinico che combini la diagnosi molecolare dell'infezione e la determinazione precoce dei microrganismi nelle emocolture con solo 6 -8 ore di incubazione prima che risultino positivi.

Endpoint

Gli endpoint primari sono:

1. - Determinare la capacità dei filmarrays BCID 2® per l'identificazione precoce di microrganismi in BC con poche ore di incubazione e prima che diventino positivi.
2. - Determinare la capacità di SeptiCyte® per la diagnosi molecolare della sepsi in pazienti critici con focus infettivo poco chiaro.

Gli endpoint secondari sono

1. - Determinare il possibile impatto dei risultati sulla gestione del trattamento antimicrobico.
2. - Determinare se esiste un'associazione tra biomarcatori sierici comuni (PCT, CRP) e risultati positivi di SeptiCyte® e BCID 2®.

Principali criteri di inclusione/esclusione

Criterio di inclusione:

1. - Adulti (>16 anni)
2. - Almeno 2 criteri SIRS
3. - RCP (> 10 mg/dL) o PCT (> 0,5 ng/mL in comunità o > 1,0 ng/mL in infezioni nosocomiali) elevati

3.- Senza un obiettivo chiaro che giustifichi la sepsi 4.- Elevato sospetto di infezione che richiede l'inizio del trattamento antimicrobico.

Criteri di esclusione:

1. - Mancato prelievo dei campioni entro 12 ore dal sospetto di infezione e somministrazione di antibiotici
2. - Precedente somministrazione di antimicrobici nelle ultime 24 ore
3. - Focalizzazione di sepsi documentata o evidente al ricovero in terapia intensiva

Procedure:

Se il paziente soddisfa i criteri di ammissione e non presenta criteri di esclusione, verrà ammesso nel protocollo diagnostico dell'algoritmo MESIS.

Non richiede una firma di consenso poiché non vengono eseguite procedure speciali, né verranno prese decisioni cliniche sulla base dei risultati dei test.

PROTOCOLLO DI DIAGNOSTICA MOLECOLARE E TRATTAMENTO PRECOCE DIRETTO (Vedi Programma di valutazione allegato) Una volta ottenuti i consueti prelievi ematici per la determinazione di PCR, PCT, conta leucocitaria (WBC) ed emocolture (4 flaconi), nonché clinicamente significativi colture, e se i criteri di inclusione sono soddisfatti, le emocolture (4 flaconi) verranno inviate insieme ad una provetta EDTA tra quelle ottenute per le consuete analisi al reparto di microbiologia dove verrà effettuata la determinazione con SeptiCyte® e BCID 2® (vedi algoritmo allegato).

A) SeptiCyte RAPID® verrà eseguito su tutti i pazienti al momento della ricezione del campione nel reparto di microbiologia. Il risultato del test verrà memorizzato nella CRF dello studio. Questo risultato non sarà noto al medico curante del paziente.

B) Il pannello di identificazione dell'emocoltura BioFire® FilmArray® (BCID 2®) verrà eseguito sui 4 flaconi per emocoltura dopo 6-8 ore di incubazione e soprattutto prima che diventi positivo. Il risultato del test verrà memorizzato nella CRF dello studio. Questo risultato non sarà noto al medico curante del paziente. Una volta che l'emocoltura è positiva, sarà eseguita una nuova determinazione del BCID 2 e il risultato sarà confrontato con quello ottenuto in precedenza con 6-8 ore di incubazione.

NOTA: In nessun caso le informazioni ricevute saranno utilizzate per definire comportamenti o trattamenti relativi allo stato del paziente. Periodo di follow-up I pazienti saranno seguiti fino a quando l'evento che ha originato il disturbo non sarà considerato risolto. Per ogni paziente sarà considerato solo il primo episodio di possibile sepsi.

I pazienti saranno classificati come sepsi confermata, probabile o possibile secondo le definizioni della "The International Sepsis Forum Consensus Conference on Definitions of Infection in the Intensive Care Unit. (Calandra T et al. Critica Cura Med 2005; 33:1538-1548).

Calcolo della dimensione del campione Secondo quanto pubblicato da Klein Klouwenberg (12), solo il 25% dei pazienti con sospetta sepsi e che ricevono antibiotici al momento del ricovero in terapia intensiva, viene infine classificato come affetto da sepsi definitiva. Il nostro studio spera di poter identificare almeno il 40% di sepsi in pazienti con sospetta sepsi. Sulla base di questa differenza e per una potenza del 90% con un livello di errore del 5%, il numero di pazienti da includere è 60.

Considerando una possibile perdita del 20% dei pazienti (17 pazienti) il numero sale a 100 pazienti. Per garantire il numero di pazienti e la potenza dello studio, si è deciso di includere un ulteriore 20%, per un totale di 120 pazienti.

Piano di analisi dei dati:

Le variabili qualitative saranno espresse in percentuale, mentre le variabili quantitative saranno espresse come media e deviazione standard (DS) o mediana e range interquartile 25-75%. Per determinare le differenze cliniche tra i gruppi con e senza BCID 2 e SeptiCyte positivi, verranno utilizzati i test Chi-quadrato e Fisher per le variabili categoriche e il test t di Student o il test U di Mann-Withney per le variabili quantitative. Verrà eseguita un'analisi multivariata mediante regressione logistica binaria per determinare i fattori di rischio associati alla presenza precoce di microrganismi in BCID 2 e per la diagnosi di alto rischio di sepsi con SeptiCyte.

Infine, sarà sviluppato un algoritmo empirico di trattamento antimicrobico per pazienti critici correlato al tipo di microrganismi isolati e ai geni di resistenza evoluti.

Limiti Il limite principale dello studio è la possibilità di mostrare un numero inferiore di pazienti con sepsi tra gli individui inclusi rispetto a quello utilizzato per calcolare la dimensione del campione. Questa situazione potrebbe portare a una mancanza di significatività statistica a causa della mancanza di potenza dello studio. Per evitare ciò, si prevede di eseguire un'analisi ad interim al raggiungimento del 70% dei pazienti. La seconda limitazione è l'inclusione di pazienti a basso tasso. Sebbene sia stato considerato che 6 mesi di lavoro sul campo saranno sufficienti, lo studio potrebbe essere esteso di altri 4 mesi per completare il numero di pazienti.

Considerazioni etiche Lo studio è al vaglio del Comitato Etico e di Ricerca Clinica di riferimento. A causa del suo design per migliorare la qualità delle cure, è stata richiesta una rinuncia al consenso informato.