Combattere l’impasse diagnostico nelle malattie mitocondriali: un approccio trascrittomico nei fibroblasti e nelle cellule del sangue (RNAseq)

Il sequenziamento di nuova generazione (NGS), e in particolare il sequenziamento dell’intero esoma (WES) o il sequenziamento del genoma (WGS), ha consentito un significativo progresso tecnico che ha notevolmente migliorato la diagnostica genetica. Tuttavia, circa il 50% dei pazienti non viene ancora diagnosticato e si trova in un limbo diagnostico. Una delle cause di ciò sono le varianti patogene che modificano l'espressione del trascritto e/o lo splicing dell'RNA. Queste varianti possono essere localizzate in regioni introniche profonde o intergeniche, o nella sequenza codificante, varianti sinonime o missenso, con conseguenze patogene sullo splicing o sull'espressione genica. Molto spesso è difficile interpretare la patogenicità di queste varianti, che spesso rimangono varianti di significato incerto (VSI). L’utilità del sequenziamento del trascrittoma (RNA-seq) nella diagnosi genetica del MM è stata dimostrata negli ultimi anni da diversi team con rendimenti diagnostici compresi tra il 10% e il 35% (Cummings et al. 2017; Kremer et al. 2017; Alston et al. , 2018). Questi studi vengono idealmente eseguiti utilizzando il tessuto muscolare, poiché i MM sono spesso espressi in tessuti con metabolismo energetico elevato come muscoli, cuore, cervello o fegato (Cummings et al. 2017). Tuttavia, poiché le biopsie di questi tessuti sono difficili da ottenere, la maggior parte degli studi di trascrizione vengono eseguiti utilizzando fibroblasti ottenuti da biopsie cutanee (Kremer et al. 2017, Saadi et al, 2022). Infatti, nei fibroblasti possono essere rilevati difetti regolatori estremi come la perdita di espressione o lo splicing aberrante, anche se le conseguenze fisiologiche sui fibroblasti possono essere trascurabili. Tuttavia, alcuni pazienti rifiutano anche queste biopsie e possono rimanere nel limbo diagnostico in assenza di analisi funzionali per confermare la patogenicità delle varianti identificate. Gli studi sull'RNA possono essere eseguiti anche utilizzando l'RNA estratto dalle cellule del sangue su provette PAXGene (Frésard et al, 2019). La quantità di RNA estratto è inferiore a quella estratta dai fibroblasti, ma questo tipo di analisi (i) evita una procedura più invasiva, (ii) fa risparmiare tempo tecnico evitando le manipolazioni associate alla coltura cellulare e (iii) fa risparmiare tempo per l'RNA paziente consentendo l'estrazione immediata dalla provetta senza attendere la coltura cellulare. Frésard et al hanno mostrato in pazienti con 16 diverse patologie mendeliane che l'RNA-seq sulle cellule del sangue ha identificato una diagnosi nel 7,5% dei pazienti testati (Frésard et al, 2019). Il loro approccio ha rivelato sia variazioni di espressione che anomalie di splicing.

Proponiamo pertanto di effettuare uno studio di trascrizione mediante sequenziamento di RNA ad alto rendimento (RNA-Seq), in parallelo su RNA estratto da fibroblasti e su RNA estratto da cellule del sangue, su 10 pazienti con sospetta malattia mitocondriale nei quali varianti di significato incerto sono stati identificati i geni candidati (VSI+).

Abbiamo scelto di indirizzare il nostro studio sui pazienti con VSI+, precedentemente identificati da NGS, per facilitare l'interpretazione dei dati RNA-Seq nel quadro di uno studio "pilota". In questi pazienti, che portano varianti nei geni candidati, concentreremo la nostra analisi bioinformatica su questi geni. Per l'interpretazione di VSI+, è anche fattibile un approccio mirato che utilizza il sequenziamento di Sanger basato su RT-PCR o la quantificazione dell'espressione genica mediante PCR quantitativa, ma richiede uno sviluppo personalizzato per ciascuna variante, il che richiede molto tempo e non è insignificantemente costoso. Il vantaggio di un approccio RNA-seq è che omogeneizza la strategia diagnostica per i pazienti, fa risparmiare tempo di analisi e quindi riduce il tempo trascorso nel vagabondare diagnostico. Infine, la drastica riduzione del costo del sequenziamento NGS significa che questa tecnica potrebbe essere utilizzata di routine come complemento al sequenziamento dell’esoma/genoma. Potrebbe quindi eventualmente essere applicato non solo ai pazienti con VSI+ ma anche, in assenza di prove di varianti potenzialmente patogene, come ausilio per filtrare le varianti identificate da WES/WGS.