Ruolo delle barriere nelle interazioni IgG-patogeni sulla superficie della mucosa nelle vie aeree umane (BARRIG)

Dall’avvento della tecnologia degli anticorpi monoclonali, gli anticorpi terapeutici (Ab) si sono dimostrati efficaci nel trattamento di una varietà di malattie. Ab ha cambiato radicalmente la gestione e il trattamento di malattie mortali, che vanno dal linfoma non Hodgkin ai sottotipi di asma. Il successo degli Ab si basa sulla loro elevata selettività, tossicità prevedibile e profili farmacologici unici, che conferiscono loro vantaggi rispetto ai farmaci a piccole molecole. Di conseguenza, gli Ab rappresentano la classe di farmaci bioterapeutici in più rapida crescita, con cinque di essi tra i farmaci più venduti negli Stati Uniti.

Le malattie respiratorie colpiscono milioni di persone in tutto il mondo; Secondo l’OMS, le quattro malattie polmonari più comunemente mortali (polmonite, tubercolosi, cancro ai polmoni e broncopneumopatia cronica ostruttiva [BPCO]) rappresentano circa un decesso su cinque in tutto il mondo nel 2030. Oltre alla mortalità prematura, le malattie respiratorie hanno un impatto drammatico sulla società in termini di disabilità, costi sanitari e perdita di produttività, sollecitando la necessità di nuove terapie. Con oltre 100 molecole in fase di valutazione clinica e una dozzina di anticorpi (Ab) che hanno ricevuto l'approvazione alla commercializzazione, gli Ab hanno un'enorme opportunità di apportare benefici ai pazienti affetti da malattie respiratorie, comprese le bronchiectasie. Attualmente gli Ab sono indicati come strategie alternative o complementari agli agenti antitumorali, antinfiammatori e antinfettivi, in particolare agli antibiotici. Il comportamento degli Ab dipende dalla loro farmacodinamica (PD) e farmacocinetica (PK), che dipendono in parte dalla loro via di somministrazione. Finora gli Ab per le malattie respiratorie vengono somministrati principalmente per via endovenosa o sottocutanea, il che non è ottimale per garantire una concentrazione terapeutica del farmaco attivo nei polmoni mentre espone altri organi al farmaco.

Per la cura delle malattie respiratorie, l'inalazione consente di agire direttamente sulle vie respiratorie. L'inalazione ha lo scopo di rilasciare farmaci per via topica - sotto forma di aerosol - attraverso il naso e/o la bocca fino al sito d'azione. L’inalazione è il gold standard per la somministrazione di farmaci ad azione topica per il trattamento dell’asma o della BPCO. L’inalazione fornisce un indice terapeutico migliore per alcuni farmaci, spesso richiede una dose ridotta rispetto ad altre vie ed è non invasiva, migliorando così l’aderenza al trattamento e il comfort del paziente. Attualmente, la maggior parte dei farmaci inalatori (topici) sono piccole molecole appartenenti a classi diverse. Gli Ab sono solitamente IgG a lunghezza intera, che sono grandi proteine ​​eterodimeriche (~150 kDa) che non diffondono passivamente attraverso le barriere cellulari. Attualmente la maggior parte degli anticorpi per le malattie respiratorie viene somministrata per via endovenosa (i.v). L'i.v. il percorso potrebbe non essere ottimale per gli Ab nel contesto di una malattia respiratoria, poiché solo una piccola frazione di Ab raggiunge i polmoni/le vie aeree dopo la somministrazione e.v. iniezione. L’inalazione è una via alternativa attraente e fattibile per la somministrazione topica di anticorpi a lunghezza intera nei polmoni. Gli anticorpi rilasciati attraverso le vie aeree mostrano risposte terapeutiche e sono per lo più trattenuti nel polmone con bassa diffusione sistemica. Nel complesso, questi risultati indicano che l’inalazione può avere un vantaggio rispetto ad altre vie di somministrazione quando gli Ab sono destinati ad operare nel tratto respiratorio.

Nonostante i vantaggi teorici della somministrazione topica di Ab per inalazione, pochi di questi benefici si sono ancora concretizzati nelle cliniche. Attualmente diversi Ab sono in fase di sviluppo clinico per inalazione, ma nessuno è ancora disponibile nelle cliniche. Questa scarsità evidenzia la complessità dello sviluppo di anticorpi inalatori e sottolinea i persistenti ostacoli da superare. Per garantire il successo della transizione dallo sviluppo preclinico a quello clinico è necessaria una comprensione dettagliata della farmacologia degli anticorpi inalati. In particolare, la deposizione di aerosol di Ab durante le malattie respiratorie può essere modulata da barriere biologiche, che possono limitare o impedire l’efficacia dell’Ab aerosol. Attualmente, gli eventi che si verificano dopo che l’Ab inalato si è depositato nelle vie aeree non sono completamente conosciuti e richiedono una caratterizzazione più approfondita.

Le bronchiectasie da fibrosi non cistica (NCFB) comprendono un gruppo di malattie croniche suppurative delle vie aeree a molteplici eziologie. Clinicamente, la NFCB è caratterizzata da una dilatazione anomala e irreversibile dei bronchi, ostruzione delle vie aeree, tosse cronica e aumento della produzione di espettorato. A livello fisiopatologico, l’infiammazione cronica, la colonizzazione batterica cronica delle vie aeree e l’aumento della produzione di muco nelle vie aeree svolgono un ruolo chiave. L’attuale trattamento per la colonizzazione microbica e/o le riacutizzazioni della NFCB si basa principalmente su antibiotici sistemici o somministrati per via aerea ad alte dosi. L'azitromicina a basso dosaggio a lungo termine viene spesso utilizzata anche per ridurre l'infiammazione delle vie aeree, i sintomi e la frequenza delle riacutizzazioni. Poiché gli antibiotici potrebbero non riuscire a migliorare i sintomi o a favorire la resistenza microbica, sono necessari nuovi trattamenti per migliorare l’eliminazione degli agenti patogeni e ridurre l’infiammazione delle vie aeree.

L’immunoglobulina policlonale G (IgG) per via inalatoria rappresenta un nuovo approccio terapeutico per la NCFB. Si prevede che le IgG inalate possano mediare effetti benefici nell'NCFB grazie alla loro capacità di ridurre la gamma di agenti patogeni respiratori in grado di infettare il tratto respiratorio, diminuire il carico polmonare delle popolazioni batteriche esistenti, migliorare la clearance mucociliare ripristinando le funzioni delle cellule epiteliali e diminuire l'infiammazione polmonare . In effetti, i pacchetti di dati preclinici hanno mostrato una riduzione del carico patogeno e del relativo danno cellulare dopo l'infezione nei roditori e nei primati non umani. Sono attualmente in corso uno studio di fase 1 su pazienti con NCFB e uno studio di tossicologia cronica per consentire uno studio di fase 2, comprendente la somministrazione giornaliera e profilattica di IgG nebulizzate per 6 mesi in pazienti con NCFB (NCT00322556, NCT00168025, NCT00168012, NCT00520494).

Nella NCFB, il muco delle vie aeree può agire come una barriera contro i farmaci inalati a livello dell’interfaccia mucosale. Mentre il muco normale si presenta come uno strato sottile che consente alle IgG di diffondersi efficacemente nei tessuti sottostanti, il muco delle vie aeree nell'NCFB è presente in quantità maggiori ed è anormalmente denso. La compromissione della quantità, della struttura e della fluidità del muco durante le bronchiectasie può quindi limitare la penetrazione degli anticorpi inalati e il loro potenziale terapeutico. I pazienti affetti da NCFB presentano frequentemente anche colonizzazione batterica cronica delle vie aeree e infiammazione cronica delle vie aeree caratterizzata da un aumento dell'attività della proteasi. Spesso soffrono anche di riacutizzazioni, che sono episodi di aumento dei sintomi guidati da agenti patogeni (in particolare P. aeruginosa e virus dell'influenza) che richiedono un intervento medico, spesso inclusa la somministrazione di antibiotici. Nel contesto di un’infiammazione eccessiva, la quantità di proteasi supera la capacità neutralizzante degli inibitori della proteasi endogena. Ciò potrebbe avere un impatto drammatico sul metabolismo degli anticorpi inalati e limitarne l’efficacia. Infatti, rapporti precedenti mostrano che la proteolisi delle IgG mediata dall'elastasi derivata dai neutrofili porta ad una diminuzione dell'anti-P. aeruginosa fagocitosi e uccisione. Oltre agli enzimi endogeni (principalmente le proteasi della serina [derivate dai neutrofili] e della cisteina [catepsina]), i patogeni batterici, come P. aeruginosa, secernono anche proteasi, che possono degradare i farmaci somministrati dalle vie respiratorie. Inoltre, agenti patogeni come P. aeruginosa inducono l'espressione di mucine.

Durante un primo studio in vitro, abbiamo valutato l'effetto barriera del muco artificiale con una viscosità nell'intervallo di quella misurata nel muco derivato dall'espettorato di pazienti con malattie respiratorie. Il CEPR ha osservato un'alterazione significativa della mobilità e della diffusione delle IgG policlonali (CSL Behring) aggiunte per via esogena, in funzione della viscosità dell'ASM. È importante sottolineare che il CEPR ha anche determinato una riduzione significativa della capacità delle IgG policlonali di legarsi a P. aeruginosa in presenza di muco viscoso rispetto al muco fluido.

Obiettivi dello studio. L'obiettivo principale è valutare l'impatto del muco derivato dall'espettorato di pazienti con NCFB sul legame di una IgG policlonale a Pseudomonas aeruginosa. I risultati ottenuti con il muco dei pazienti NCFB verranno confrontati con i risultati ottenuti utilizzando muco artificiale. Gli obiettivi secondari sono la caratterizzazione di 1) mobilità esogena delle IgG policlonali e 2) stabilità nel muco derivato dall'espettorato di pazienti NCFB. Inoltre, verrà esplorato l'impatto della colonizzazione microbica delle vie aeree sulla farmacodinamica delle IgG.

Progettazione dello studio. Si tratta di uno studio esplorativo, prospettico, monocentrico, trasversale, interventistico con rischi e vincoli minimi su pazienti affetti da bronchiectasie non fibrose cistica (NCFB) seguiti dal Centro per le malattie polmonari rare e dal Dipartimento di pneumologia dell'Ospedale universitario di Tours (CHRU Tours). I pazienti inclusi nello studio continueranno il loro consueto follow-up. La consueta gestione medica - diagnostica e/o terapeutica - non sarà modificata dalla partecipazione allo studio a parte un ulteriore studio microbiologico dell'espettorato come parte dello studio.

Questo studio si concentrerà sull'analisi delle proprietà biochimiche e biofisiche di una preparazione terapeutica di IgG policlonali in presenza di espettorato isolato da pazienti NCFB, e più specificamente sulla capacità delle IgG di riconoscere un bersaglio. Verranno inoltre valutate la mobilità e la stabilità delle IgG nel muco delle vie aeree. Al fine di associare gli endpoint PD - misurati al CEPR - con parametri clinicamente rilevanti, la raccolta dell'espettorato sarà accompagnata dalla documentazione, nel muco e nel sangue, dei parametri microbiologici (analisi virologiche e batteriologiche) e infiammatori (formulazione del sangue, proteina C-reattiva) parametri - misurati al CHRU di Tours.

Le analisi nel compartimento del sangue verranno effettuate utilizzando un volume aggiuntivo di sangue prelevato al momento della visita, rispettando i limiti e le controindicazioni (in conformità con l'ordinanza del 4 aprile 2018 dell'articolo L.1121-1 della Sanità pubblica codice). L'analisi delle vie aeree verrà effettuata utilizzando l'espettorato raccolto dai pazienti. Verrà pianificato un unico punto di analisi per ciascun paziente incluso nello studio.

Misure di risultato. Il risultato principale è la quantificazione del legame delle IgG policlonali allo Pseudomonas aeruginosa in presenza di muco derivato dall'espettorato di pazienti NCFB. Il legame sarà valutato mediante ELISA su cellule intere.

I risultati saranno espressi come percentuale di legame rispetto a quello ottenuto quando le IgG policlonali vengono aggiunte in soluzione salina e saranno confrontati con preparati di muco artificiale in un intervallo di viscosità simile al muco delle vie aeree umane.

Gli esiti secondari sono: (1) la misurazione della proteolisi, mediante Western-Blot, delle IgG policlonali esogene aggiunte nel muco derivato dall'espettorato di pazienti NCFB. I risultati saranno espressi come percentuale di integrità rispetto a quella ottenuta quando le IgG policlonali vengono aggiunte in soluzione salina e verranno confrontati con i risultati in vitro; (2) la misurazione della mobilità mediante FRAP di IgG policlonali esogeni marcati con fluorescenza aggiunti nel muco derivato dall'espettorato di pazienti NCFB. I risultati includeranno la determinazione della frazione t(1/2), mobile e immobile rispetto a quella ottenuta quando le IgG policlonali vengono aggiunte in soluzione salina e verranno confrontati con i risultati in vitro. Ciò sarà fatto al CEPR. (3) impatto della colonizzazione microbica delle vie aeree sul legame delle IgG, sulla proteolisi e sulla mobilità delle Ig. I campioni con colonizzazione microbica (batterica, virale o fungina) verranno confrontati con campioni non colonizzati.

Selezione e reclutamento di persone idonee alla ricerca. La popolazione in studio comprende tutti i pazienti con età ≥ 18 anni affetti da NCFB e seguiti dal centro per le malattie polmonari rare/dipartimento di pneumologia del CHRU Tours (l'elenco attivo comprende 181 pazienti con NFCB idiopatico a settembre 2023). Questi pazienti si sottopongono regolarmente a visite cliniche, inclusa la spirometria forzata, almeno una volta all'anno. In questo studio trasversale, i pazienti verranno selezionati sulla base delle cartelle cliniche del Centro per le malattie polmonari rare dell'ospedale universitario di Tours (CHRU Bretonneau). In particolare, i pazienti verranno sottoposti a screening per la produzione cronica di espettorato. Si stima che un terzo di tutti i pazienti potrebbero essere idonei allo studio. Ai pazienti idonei verrà offerta la possibilità di partecipare al momento della visita programmata in ospedale o tramite telefonata da parte di un assistente di ricerca o di un infermiere ricercatore. Ai pazienti interessati allo studio verrà fornito il documento informativo per ulteriori informazioni. Quando i pazienti danno il consenso orale per partecipare allo studio, saranno invitati a venire per una visita presso il Centro di ricerca clinica (CIC Inserm 1415) dell'ospedale. I pazienti incontreranno quindi un investigatore. Per essere coinvolto, un soggetto deve soddisfare tutti i criteri di inclusione e nessun criterio di non inclusione. Il consenso sarà confermato dallo sperimentatore dopo un incontro con il soggetto e la revisione della lettera di consenso.

Visita di studio. Al momento dell'inclusione, il paziente parteciperà a una visita da parte di un investigatore per registrare l'esame clinico e i segni vitali, la data dell'ultima esacerbazione acuta, l'anamnesi medica, il trattamento e il questionario respiratorio di San Giorgio (misurazione della qualità della vita). La descrizione delle bronchiectasie dall'ultima tomografia computerizzata (CT), la gravità della compromissione della funzione polmonare definita dall'ultima spirometria (FEV1) e l'indice di gravità delle bronchiectasie saranno convalidati da uno pneumologo esperto.

Raccolta dati clinici.

Al momento dell'inclusione, il paziente parteciperà a una visita da parte di un investigatore per registrare:

• Storia medica
• Trattamento attuale
• Esame clinico e segni vitali (pressione sanguigna, frequenza cardiaca, saturazione dell'emoglobina percutanea-SPO2 durante la respirazione dell'aria ambiente)
• Scala della dispnea mMRC
• Descrizione della gravità delle bronchiectasie dall'ultima TC, utilizzando il Bronchiectasis Radiologically Indexed CT Score (BRICS) e il numero di lobi coinvolti 19
• Gravità della compromissione del flusso aereo (espirazione forzata in 1 secondo-FEV1) dall'ultima spirometria. Il FEV1 è espresso come percentuale del valore previsto utilizzando le equazioni di riferimento GLI2012
• Data dell'ultima riacutizzazione (definita come aumento dei sintomi respiratori della durata di >48 ore e una nuova prescrizione di antibiotici)
• Numero e data delle riacutizzazioni gravi che hanno richiesto il ricovero ospedaliero
• Numero di riacutizzazioni che hanno richiesto terapia antibiotica nell’ultimo anno
• Questionario respiratorio di San Giorgio (misura della qualità della vita)
• Storia di colonizzazione delle vie aeree da parte di Pseudomonas o altri batteri

Raccolta di campioni di sangue ed espettorato inalato. Dopo la visita medica, un'infermiera del CIC preleverà 3x5 ml di sangue venoso per le analisi ematologiche e biochimiche. 1 provetta verrà utilizzata per le analisi immunologiche effettuate presso il CEPR.

Dopo la raccolta del sangue, i soggetti riceveranno un aerosol di NaCl allo 0,9% se la SPO2 mentre respirano l'aria della stanza è ≥ 94% e verranno raccolti campioni di espettorato indotto. I passaggi chiave della somministrazione dell'aerosol e della raccolta dell'espettorato sono:

• Il paziente si sciacqua la bocca con acqua potabile (per ridurre la contaminazione del campione con la saliva)
• Il paziente si soffia il naso (per ridurre la contaminazione del campione con il muco delle vie aeree superiori)
• Iniziare la nebulizzazione di 15 ml di NaCl allo 0,9% erogati tramite un nebulizzatore pneumatico (6 l/min di aria)
• Durante e immediatamente dopo l'aerosol di NaCl, il soggetto è incoraggiato a espettorare in una provetta da 50 ml almeno 3 volte (5, 10, 15 minuti).

Analisi del campione. Immediatamente dopo la raccolta, il campione di espettorato verrà inviato ai dipartimenti di Batteriologia, Virologia e Micologia del CHRU Tours per la caratterizzazione delle popolazioni microbiche (colorazione di Gram e colture batteriche, colorazione di Gomori-Grocott e colture fungine, multiplex RTPCR per patogeni respiratori). Il campione di espettorato rimanente verrà quindi inviato al CEPR per le analisi farmacologiche del preparato IgG. I campioni non utilizzati o rimanenti verranno conservati presso il CEPR in una raccolta specifica per ulteriori sperimentazioni. Saranno conservati per un periodo di tempo illimitato.

I campioni di sangue verranno inviati ai laboratori di ematologia e biochimica per la conta delle cellule del sangue e i test della proteina C-reattiva. 1 provetta verrà utilizzata per l'analisi immunologica (fenotipizzazione dei neutrofili, misurazione delle IgG totali) effettuata presso il CEPR.

Non è previsto alcun follow-up del soggetto come parte dello studio.