Efficacia della chirurgia con lembo di accesso sui peridonti patgogeni sottogengivali in soggetti con parodontite

I partecipanti al presente studio erano individui con diagnosi di parodontite di stadio III grado B, come determinato dai criteri stabiliti nel Workshop mondiale 2017 per la classificazione delle malattie e condizioni parodontali.

Il trattamento parodontale non chirurgico è stato somministrato a tutti i quadranti dei pazienti programmati per partecipare allo studio, utilizzando strumenti parodontali manuali (curette Gracey, Hu-Friedy®; Chicago, IL) in combinazione con un dispositivo a ultrasuoni (Cavitron Plus, Dentsply®, Duisburg , Germania). Ogni paziente è stato sottoposto alla prima fase del trattamento parodontale non chirurgico, che prevedeva la rimozione meccanica dei depositi sopragengivali, motivazione e istruzioni personalizzate di igiene orale, compreso il controllo della placca interdentale e lo spazzolino da denti utilizzando la tecnica di Bass modificata. Nella prima settimana successiva alla sessione iniziale, la seconda fase del trattamento parodontale non chirurgico, che comprendeva la strumentazione sottogengivale (SI), è stata eseguita su tutti e quattro i quadranti in un unico appuntamento somministrato dallo stesso operatore in cieco. I pazienti non hanno ricevuto alcun farmaco o collutorio prescritto. Alla visita di follow-up a un mese dall'IS (14 giorni prima dell'intervento chirurgico), i pazienti sono stati riesaminati clinicamente e la loro conformità ai criteri di inclusione/esclusione è stata rivalutata. I pazienti che necessitavano di un intervento chirurgico con lembo di accesso, indicato dalla presenza di tasche residue profonde (PD ≥ 6 mm), sono stati identificati e sottoposti alla procedura di randomizzazione. Diversi siti di pazienti partecipanti programmati per un intervento di chirurgia parodontale sono stati assegnati come siti di accesso alla chirurgia del lembo (gruppo test) o siti non trattati (gruppo di controllo) attraverso una procedura di randomizzazione. Altri pazienti che hanno ritenuto di non necessitare di un intervento chirurgico con lembo di accesso non sono stati inclusi nello studio e sono stati invece arruolati in una ripetizione della strumentazione sottogengivale o in un programma di terapia parodontale di supporto.

Ai pazienti sono stati assegnati numeri ascendenti consecutivi durante la visita di arruolamento. Prima dell'inizio dello studio, l'ordine dei quadranti di trattamento è stato randomizzato da un ricercatore non direttamente coinvolto nell'esame o nel processo di trattamento, utilizzando sequenze casuali generate da un generatore computerizzato di numeri casuali. L'occultamento dell'allocazione è stato ottenuto utilizzando buste opache sigillate, numerate in sequenza. Sulla base di questo processo, i denti del sito destro o sinistro sono stati designati come gruppo di prova, mentre quelli del sito opposto sono stati assegnati al gruppo di controllo. L'assegnazione è rimasta nascosta all'esaminatore durante l'esame parodontale e le registrazioni e la busta non è stata aperta dall'operatore fino alla prima visita di trattamento.

Ciascun paziente che soddisfaceva i criteri dello studio è stato sottoposto a uno dei seguenti trattamenti: un lato della bocca è stato trattato con AFS, mentre i quadranti controlaterali fungevano da controllo. Tutti gli interventi di accesso sono stati condotti dallo stesso parodontologo in cieco. Dopo l'anestesia locale, il lembo mucoperiosteo è stato sollevato e maneggiato con strumenti microchirurgici (lame, bisturi, porta-aghi, forbici e pinzette, Carl Martin GmbH, Solingen, Germania) secondo la procedura semplificata Tecnica del lembo di conservazione della papilla (SPFF). Il tessuto di granulazione attaccato all'osso alveolare è stato asportato per garantire un accesso completo e una visibilità ottimale delle superfici radicolari. Inoltre, la strumentazione è stata eseguita utilizzando una combinazione di strumenti a ultrasuoni e manuali e non è stata effettuata alcuna modifica dell'osso alveolare durante la procedura del lembo. Successivamente, il lembo mucoperiosteo è stato riposizionato e chiuso principalmente con suture prossimali semplici utilizzando materiale di sutura monofilamento (5/0 Propilen, Dogsan, Türkiye). Ai pazienti sono state fornite raccomandazioni postoperatorie; tuttavia, non è stato prescritto alcun farmaco.

Le misurazioni parodontali, tra cui profondità di sondaggio (PD) (mm), livello di attacco clinico (CAL) (mm), sanguinamento al sondaggio (BOP) (±), indice gengivale (GI) e indice di placca (PI), sono state valutate in due momenti distinti intervalli da un parodontologo calibrato che era cieco rispetto ai siti sperimentali.20 Queste misurazioni sono state condotte su sei diversi aspetti di ciascun dente (disto-buccale/labiale, medio-buccale/labiale, mesio-buccale/labiale, disto-linguale/palatinale, medio-linguale/palatinale e mesio-linguale/palatinale) utilizzando una sonda parodontale manuale (sonda Williams, Hu-Friedy®; Chicago, IL) ed è stato calcolato il valore medio. Per valutare la guarigione dei tessuti parodontali, sono stati registrati punteggi parodontali dettagliati prima e quattro settimane dopo l’intervento chirurgico con lembo di accesso.

Tra i punteggi parodontali registrati per ciascun paziente, quattro denti (due per il gruppo di trattamento e due per il gruppo di controllo) che mostravano i punteggi più alti (PD ≥ 6 mm, CAL ≥ 5 mm) sono stati designati come siti donatori per il campionamento della placca sottogengivale. La raccolta dei campioni è stata effettuata prima e un mese dopo l'intervento chirurgico dallo sperimentatore responsabile dell'esecuzione delle misurazioni cliniche. I siti di campionamento sono stati isolati utilizzando rulli di cotone sterili, seguiti dalla rimozione della placca sopragengivale dalla superficie del dente. Successivamente, punte di carta sterilizzate (Paperpoint #50, EndoPoint®, Paraiba do Sul, RJ, Brasile) sono state delicatamente inserite nelle tasche parodontali designate, esercitando una leggera pressione fino a incontrare una lieve resistenza. I punti di carta sono stati trattenuti all'interno della tasca parodontale per 20 secondi prima di essere trasferiti con cura in provette sterili per microcentrifuga, tappate saldamente per la conservazione. I campioni sono stati conservati in un congelatore a -80°C presso il Centro applicativo di ricerca e sviluppo tecnologico dell'Università di Trakya.

L'identificazione genetica molecolare e la quantificazione degli agenti parodontopatogeni sottogengivali sono state eseguite da un operatore che non era a conoscenza della distribuzione del gruppo. Per l'isolamento del DNA è stato utilizzato il PureLink® Genomic DNA Mini Kit (INVITROGEN, Massachusetts, USA). I campioni contenuti in provette da centrifuga da 1,5 ml sono stati scongelati a temperatura ambiente per la dissoluzione dopo essere stati recuperati dal congelatore a -80°C. L'isolamento del DNA è avvenuto secondo le istruzioni del produttore, prevedendo fasi sequenziali di lisi cellulare, legame del DNA alle membrane filtranti, lavaggio ed eluizione. Successivamente, le provette contenenti i campioni sono state sottoposte a centrifugazione a 21.300 x g per 1 minuto per ottenere DNA genomico puro dei microrganismi. Questi campioni di DNA isolati sono stati conservati a -20°C fino alla fase PCR.

Nell'ambito della metodologia PCR quantitativa in tempo reale, sono state utilizzate sonde TaqMan® (Applied Biosystems™, CA, USA) marcate con fluorocromi (sostanze fluorescenti) ai terminali 5' e 3'. Il kit TaqMan Multiplex Master è una comoda premiscela di tutti i componenti necessari, oltre a primer e sonde, per eseguire qPCR. Contiene DNA polimerasi, dNTP (adenosina trifosfato, guanosina trifosfato, timidina trifosfato, citidina trifosfato), KCL o MgCL2 e tampone polimerasi. Lo scopo di questa tecnologia è quello di rilevare sequenze note di DNA genomico, plasmidico o complementare (cDNA) sia qualitativamente che quantitativamente.

Per le analisi PCR, 20 μl di master mix (Applied Biosystems™, CA, USA) sono stati collocati in micropiastre da 96 pozzetti. Quindi, 5 μl del campione di DNA prelevato da ciascun caso sono stati aggiunti ad alcuni di questi pozzetti per fungere da test, mentre 5 μl del campione prelevato da 3 pazienti sani, che non erano stati inclusi nello studio, sono stati aggiunti ai restanti pozzetti. pozzi per fungere da controllo interno. Queste miscele, ciascuna con un volume totale di 25 μL, sono state eseguite sulla macchina PCR (ABI 7500 Fast Real-Time PCR System, Applied Biosystems™, CA, USA). Il protocollo dello studio qPCR comprendeva i seguenti passaggi: una fase di attivazione della polimerasi ( 1 ciclo a 95 °C per 3 min), una fase di denaturazione (40 cicli a 95 °C per 15 s) e una fase di ricottura/estensione (40 cicli a 5 °C per 30 s).

Nell'ambito del metodo qPCR, un aumento del numero di cicli corrisponde ad un concomitante aumento della quantità di DNA rilevata dal colorante fluorescente. Il valore del ciclo di soglia (Ct) si riferisce al numero di cicli al quale la radiazione di fluorescenza supera una soglia predeterminata durante l'amplificazione. Nel presente studio, i valori Ct ottenuti dai risultati dell'analisi dei campioni di placca sottogengivale sono stati integrati nella formula 2-ΔCt per calcolare la differenza nel cambiamento di piega che si verifica nelle quantità di microrganismi. La disparità tra i batteri bersaglio rilevata al basale e successivamente il 1° mese è stato calcolato utilizzando la seguente formula:

ΔCt: [Ct_batteri target nel 1° mese] - [Ct_batteri target nel basale] La variazione delle quantità dei batteri target nel 1° mese rispetto al basale: 2-Δ∆Ct Tutte le analisi sono state condotte utilizzando il pacchetto software SPSS versione 23 (IBM Corp, Armonk, New York). Sono stati definiti due gruppi, test e controllo, con una differenza sostanziale nella dimensione dell'effetto (0,4) nelle quantità microbiche e un livello di significatività di 0,05. Per valutare le correlazioni nelle misurazioni ripetute con un coefficiente di correlazione di 0,5, è stata determinata una dimensione del campione di 40 casi (20 test - 20 controlli) utilizzando il software G*Power 3.1.9.2. Il livello di significatività è stato fissato a p <0,05.

Le variabili continue sono state valutate per la normalità utilizzando il test di Shapiro-Wilk. Successivamente, sulla base del presupposto della distribuzione normale, sono stati condotti confronti tra gruppi indipendenti utilizzando il test t di Student o il test U di Mann-Whitney. Per i confronti tra gruppi dipendenti, le analisi hanno utilizzato il test t accoppiato o il test di Wilcoxon.

La correlazione tra variabili continue è stata studiata mediante l'analisi di correlazione di Spearman. Le variabili continue sono state descritte in termini di media ± deviazione standard (SD), mediana (intervallo interquartile (IQR)) e intervallo (minimo-massimo), mentre le variabili categoriche erano rappresentate da frequenza e percentuale.