Previsione a Lungo Termine del Rischio di HCC Correlato a MASH tramite Proteomica (PROTEOMASH)

Introduzione La MASH è una malattia epatica progressiva, riconosciuta come una forma grave di MASLD, caratterizzata istologicamente da steatosi epatica accompagnata da infiammazione epatocellulare e degenerazione ballooning. Rappresenta una preoccupazione crescente per la salute pubblica a causa della sua forte associazione con componenti della sindrome metabolica come obesità, insulino-resistenza, diabete mellito di tipo 2, ipertensione e dislipidemia. A livello globale, la prevalenza di MASLD è stimata essere approssimativamente del 25%, con la MASH che colpisce una parte sostanziale di questi pazienti, in particolare quelli con disturbi metabolici comorbidi.

La progressione della MASH è eterogenea e può portare a fibrosi avanzata, cirrosi e carcinoma epatocellulare (HCC). È importante notare che, mentre la cirrosi è un fattore di rischio ben noto per l'HCC, recenti studi epidemiologici e clinici hanno dimostrato che l'HCC può svilupparsi anche in fegati non cirrotici affetti da MASH. Questo fenomeno complica le decisioni cliniche riguardanti sorveglianza e gestione, poiché le attuali linee guida raccomandano principalmente lo screening per l'HCC in pazienti con cirrosi indipendentemente dall'eziologia.

La patogenesi della MASH e la sua progressione verso l'HCC coinvolge complesse interazioni tra alterazioni metaboliche, infiammazione epatica cronica, stress ossidativo, disfunzione mitocondriale, lipotossicità e attivazione di vie fibrogeniche. L'accumulo eccessivo di acidi grassi liberi e metaboliti lipidici tossici negli epatociti induce stress cellulare, innescando cascate infiammatorie e apoptosi. Le cellule di Kupffer e le cellule immunitarie reclutate perpetuano l'ambiente infiammatorio, contribuendo alla fibrosi progressiva.

L'incidenza crescente di HCC correlato a MASH sottolinea l'urgente necessità di nuovi biomarcatori in grado di stratificare accuratamente i pazienti in base al loro rischio di sviluppo di HCC. L'identificazione precoce di individui ad alto rischio consentirebbe strategie di sorveglianza personalizzate, diagnosi precoce e interventi terapeutici tempestivi, potenzialmente migliorando gli esiti clinici. Sfortunatamente, i biomarcatori sierologici, incluso l'alfa-fetoproteina (AFP), hanno sensibilità e specificità limitate per la rilevazione precoce dell'HCC nella popolazione con MASH. Pertanto, nuovi marcatori molecolari che riflettono la fisiopatologia sottostante della MASH e dell'epatocarcinogenesi sono attivamente oggetto di indagine.

La proteomica, lo studio su larga scala delle proteine espresse da cellule o tessuti, offre vantaggi unici per la scoperta di biomarcatori nella MASH e nell'HCC. Le proteine sono gli effettori funzionali dei processi cellulari e possono riflettere meglio i cambiamenti patologici dinamici rispetto ai soli dati genomici o trascrittomici.

Il profilo proteomico tissutale mediante spettrometria di massa è uno strumento innovativo e promettente ben adatto all'identificazione di firme proteomiche prognostiche. Questa metodologia è stata sviluppata presso il laboratorio U1312 BRIC (team 3, Carcinomi epatici e invasione tumorale) in collaborazione con la piattaforma Oncoprot (UMS 005-TBMcore). Partendo da un campione di tessuto fissato in formalina e incluso in paraffina (FFPE), viene selezionata una regione di interesse e microdissezionata con laser. Le proteine vengono quindi estratte, la fissazione viene invertita e le proteine vengono digerite usando la tripsina. I peptidi risultanti vengono successivamente analizzati mediante cromatografia liquida accoppiata a spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) su uno spettrometro di massa ad alta risoluzione. L'elaborazione dei dati è eseguita da un bioinformatico: ogni campione viene confrontato con un campione di riferimento (ad es., tessuto epatico sano), consentendo il calcolo delle intensità di espressione proteica relative (rapporti di abbondanza proteica). Due campioni possono quindi essere confrontati utilizzando un metodo di quantificazione a triangolazione, che implica il confronto dei rapporti di abbondanza proteica tra i campioni. Tutte le proteine che mostrano rapporti di abbondanza significativamente diversi tra i due campioni costituiscono il profilo proteomico.

I progressi nelle tecnologie proteomiche basate sulla spettrometria di massa ora consentono un'analisi ad alto rendimento, sensibile e quantitativa dei profili di espressione proteica da piccole quantità di tessuto, inclusi campioni fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE) raccolti di routine durante le biopsie epatiche diagnostiche. Ciò consente analisi retrospettive di coorti di pazienti ben caratterizzate e facilita l'integrazione dei dati proteomici con gli esiti clinici.

Disegno dello studio e metodologia Questo studio si basa sull'analisi retrospettiva di una coorte di n=30 pazienti dell'Ospedale Universitario di Bordeaux (CHU), con campioni biologici e dati clinici già raccolti come parte dell'assistenza di routine. Poiché la trasformazione maligna della MASLD (Steatoepatite Associata a Metabolismo) è un processo lungo (diversi anni), questo approccio retrospettivo garantisce la fattibilità dello studio e l'acquisizione rapida dei risultati.

Per affrontare le ipotesi dichiarate, questo studio si baserà sull'analisi retrospettiva dei dati clinici dei pazienti nella coorte del dipartimento di epatologia del CHU di Bordeaux (registrata con gli identificatori ClinicalTrials.gov NCT01241227 e NCT02060565), nonché sull'analisi proteomica delle biopsie epatiche degli stessi pazienti, disponibili presso la Biobanca del Cancro del CHU di Bordeaux (CRB). La coorte del CHU di Bordeaux attualmente include oltre 7000 pazienti MASLD arruolati alla diagnosi e seguiti prospetticamente fino ad oggi. Il primo paziente è stato incluso nel 2003, fornendo fino a 20 anni di follow-up per i primi arruolati, rendendo questa coorte una risorsa preziosa per studiare il rischio di trasformazione maligna.

I dati clinici sono stati raccolti utilizzando una procedura standardizzata all'interno di un database esistente, garantendo la qualità e la completezza dei dati per questo progetto. I dati proteomici delle biopsie epatiche dei pazienti inclusi nello studio ProteoMASH saranno recuperati da un database dedicato istituito presso Inserm U1312 e incrociati con i dati clinici del database CHU (come sviluppo di carcinoma epatocellulare [HCC] durante il follow-up, durata del follow-up dalla diagnosi, presenza di diabete, ecc.), con l'obiettivo di validare il valore diagnostico e prognostico di questi nuovi marcatori biologici.

Per questo studio, utilizzeremo frammenti di biopsia ottenuti durante l'assistenza clinica di routine. I dati clinici saranno estratti dalle cartelle cliniche dei pazienti all'interno del database del servizio; nessuna procedura aggiuntiva o visita di follow-up sarà imposta ai pazienti, poiché i dati di follow-up sono raccolti come parte dell'assistenza standard.

I pazienti della coorte CHU di Bordeaux saranno classificati in due sottogruppi:

• Gruppo 1 (n=15): pazienti con una biopsia epatica diagnostica per MASLD prima dello sviluppo di HCC, con un intervallo di tempo tra biopsia e diagnosi di HCC compreso tra 1 e 15 anni.
• Gruppo 2 (n=15): pazienti di controllo con una biopsia epatica diagnostica per MASLD che non hanno sviluppato HCC durante il follow-up.

I potenziali bias inerenti alle coorti retrospettive saranno controllati nel modo più efficace possibile:

I pazienti di controllo (Gruppo 2) saranno selezionati tenendo conto dei fattori di rischio noti per l'HCC come età, sesso, presenza e controllo del diabete (definito da HbA1c <8% secondo le linee guida francesi) e stadio di fibrosi (definito istologicamente da F0: nessuna fibrosi a F4: cirrosi). L'obiettivo è garantire che questi fattori di rischio siano distribuiti in modo simile tra i gruppi.

Inoltre, ci assicureremo che i pazienti del Gruppo 2 siano stati seguiti per almeno 5 anni con supporto di imaging (ecografia, TC o RM) per confermare che nessun HCC potrebbe essere stato perso.

Per il Gruppo 1, saranno utilizzati criteri diagnostici oggettivi per l'HCC, basati su imaging (TC o RM seguendo i criteri LI-RADS dell'American College of Radiology) o istopatologia (nuova biopsia o resezione chirurgica), per minimizzare il bias di classificazione. Inoltre, per escludere la possibilità di HCC occulto al momento della biopsia epatica, saranno inclusi solo pazienti con HCC diagnosticato più di un anno dopo la biopsia, con imaging (ecografia, TC o RM) che confermi l'assenza di HCC almeno un anno dopo la biopsia e prima della diagnosi di HCC.

Un altro potenziale bias riguarda i pazienti persi al follow-up (ad es., seguiti in altri centri, deceduti prima di 15 anni senza sviluppo di HCC), che saranno esclusi dall'analisi e potrebbero avere un rischio di HCC diverso. Pertanto, non possiamo essere certi che i pazienti del Gruppo 2 rappresentino pienamente tutti i pazienti MASLD che non sviluppano HCC. Tuttavia, questa limitazione è giustificata dalla natura esplorativa dello studio ProteoMASH e sarà considerata in progetti futuri.

Inoltre, i pazienti saranno inclusi in periodi di tempo omogenei per evitare confondimenti dovuti a cambiamenti nella gestione medica nel tempo.

Infine, i dati clinici raccolti di routine già disponibili nel database esistente (ad es., valori di HbA1c per il controllo del diabete, stadio di fibrosi definito istologicamente) saranno utilizzati per minimizzare il bias dei dati mancanti.

Le biopsie epatiche FFPE saranno sottoposte a flussi di lavoro proteomici ottimizzati e i set di dati proteomici risultanti saranno analizzati utilizzando pipeline bioinformatiche per identificare proteine o pannelli espressi in modo differenziale tra i gruppi HCC e non-HCC. Le proteine identificate saranno annotate per le loro funzioni biologiche, vie e coinvolgimento nell'epatocarcinogenesi.

Implicazioni cliniche e di ricerca L'identificazione di robusti biomarcatori proteomici per il rischio di HCC nei pazienti con MASH può avere profonde implicazioni cliniche. L'incorporazione di tali biomarcatori nei flussi di lavoro clinici potrebbe perfezionare gli algoritmi di stratificazione del rischio oltre la sola stadiazione della fibrosi, consentendo programmi di sorveglianza personalizzati adattati ai profili di rischio molecolare individuali.

Inoltre, i biomarcatori proteomici possono servire come bersagli terapeutici o indicatori della risposta al trattamento negli interventi farmacologici emergenti per la MASH e l'HCC precoce, facilitando approcci di medicina di precisione.

Studi futuri dovrebbero concentrarsi sulla validazione di questi biomarcatori in coorti più ampie e multicentriche e sull'integrazione dei dati proteomici con altre modalità omiche (genomica, metabolomica) e parametri clinici. Il campionamento longitudinale e le analisi proteomiche seriali potrebbero chiarire le dinamiche temporali della progressione della malattia e le fluttuazioni dei biomarcatori.

Conclusione In conclusione, l'applicazione della proteomica tissutale a campioni di biopsia epatica FFPE da pazienti con steatoepatite associata a metabolismo rappresenta una strategia promettente per identificare nuovi biomarcatori predittivi del rischio di carcinoma epatocellulare. Questo approccio affronta limitazioni critiche dei metodi diagnostici attuali e offre una via verso un miglior rilevamento precoce, una valutazione personalizzata del rischio e, in definitiva, migliori esiti per i pazienti nella popolazione in crescita affetta da MASH.