Un nuovo approccio alla misurazione del dispendio energetico negli esseri umani

L'elevata prevalenza dell'obesità negli Stati Uniti (17) è una delle principali preoccupazioni per la salute pubblica, poiché gli individui in sovrappeso e obesi sono a maggior rischio di molte malattie croniche (5, 7, 15, 18). L'obesità deriva da uno squilibrio tra consumo calorico totale e dispendio energetico totale (TEE), anche se le cause di questo squilibrio rimangono dibattute (29). Misurazioni accurate e precise di TEE svolgono quindi un ruolo fondamentale nella comprensione e, infine, nell'invertire questa epidemia. La TEE può essere misurata utilizzando la calorimetria diretta (misurazione della produzione di calore) o indiretta (misurazione dello scambio di gas respiratori) (4), ma nessuno di questi approcci è pratico per misurare la TEE in soggetti a vita libera. Il gold standard per la misurazione della TEE negli individui a vita libera è il metodo dell'acqua doppiamente etichettata (DLW), che si basa sul principio che l'ossigeno nell'acqua corporea è in completo equilibrio isotopico con l'ossigeno nell'anidride carbonica respiratoria disciolta a causa dell'azione di anidrasi carbonica. La conseguenza di questo scambio è che un'etichetta isotopica di ossigeno introdotta nell'acqua corporea viene eliminata dal flusso combinato di acqua corporea e anidride carbonica espirata. Lifson e colleghi hanno sostenuto che, poiché l'idrogeno si trova solo nell'acqua e non nell'anidride carbonica, l'eliminazione di un isotopo di idrogeno sarebbe influenzata esclusivamente dal flusso di acqua corporea (11). Quindi la differenza nei tassi di eliminazione degli isotopi delle etichette di ossigeno e idrogeno somministrate simultaneamente è una misura della produzione di CO2.

Tuttavia, nonostante il suo uso diffuso (6, 9, 10, 20, 25, 29), il metodo DLW presenta alcune importanti limitazioni. Le misurazioni individuali sono precise solo fino a ± 7% nella migliore delle ipotesi (23), quindi il metodo è attualmente più adatto per studi di gruppi piuttosto che per variazioni individuali. Un secondo problema è che il test è costoso da eseguire a causa della necessità di campioni di dimensioni relativamente grandi per ottenere una potenza statistica sufficiente, delle grandi quantità di H218O necessarie per il dosaggio (23) e dell'analisi IRMS. Sono necessari alti livelli di 18O per distinguere la dose dai livelli isotopici di base dopo 10-21 giorni dall'eliminazione. Attualmente costa $ 500 - $ 750 per il 18O necessario per eseguire una misurazione DLW su un soggetto adulto (50 - 75 kg di massa magra) e il costo è imprevedibile a causa delle fluttuazioni della domanda dalla PET diagnostica medica. La necessità di elevati arricchimenti di 18O è causata dalle fluttuazioni nel tempo dei livelli di isotopi di fondo (8). Questa incertezza nei livelli di fondo aumenta la dose di isotopo che deve essere somministrata e contribuisce all'incertezza nelle misurazioni DLW rispetto alle misurazioni calorimetriche di riferimento di TEE negli studi di convalida. Infine, l'analisi IRMS presenta una serie di sfide, tra cui la necessità di strumentazione sofisticata e costosa con operatori dedicati e altamente qualificati e, in generale, la misurazione di un solo rapporto isotopico alla volta, riducendo la produttività analitica. A causa di queste sfide, la maggior parte dei ricercatori che conducono i test DLW non mantiene strutture IRMS interne, affidandosi invece a analisi costose e lente da parte di laboratori di misurazione esterni. Il lavoro proposto affronterà questi problemi sviluppando un nuovo metodo a triplo isotopo per l'analisi DLW, migliorando significativamente l'accuratezza individuale delle misurazioni e riducendo il costo del metodo DLW, portando a un uso più diffuso del metodo DLW sia nella clinica che nella ricerca applicazioni.

L'obiettivo generale di questa sovvenzione di fase II per Small Business Innovation Research (SBIR) è sviluppare e convalidare un nuovo strumento per misurare e correggere i livelli isotopici di fondo di 18O e 2H durante l'analisi DLW misurando l'isotopo stabile 17O dell'ossigeno nell'acqua corporea . Questo approccio affronterà le due principali limitazioni sopra menzionate. In primo luogo, utilizzando le misurazioni del 17O per correggere le fluttuazioni di fondo in 18O e 2H, questo approccio ridurrà la quantità di 18O, e quindi il costo, dell'esecuzione di studi DLW. I risultati dei nostri studi di fase I (vedere i dati preliminari di seguito) mostrano che le fluttuazioni di fondo in 18O e 17O nell'acqua corporea sono correlate con un R2 di 0,96, le fluttuazioni di fondo in 2H e 17O sono correlate con un R2 di 0,89 e le fluttuazioni di fondo in 2H e 18O sono correlati con un R2 di 0,92. Sulla base di queste correlazioni, l'utilizzo delle misurazioni del 17O per stimare le fluttuazioni di fondo del 2H e del 18O fornirà una diminuzione stimata del 40% nell'incertezza del metodo DLW dovuta alla fluttuazione del fondo. In secondo luogo, lo strumento proposto sarà utilizzato nel nuovo metodo a triplo isotopo per DLW che ridurrà gli ostacoli esistenti all'uso diffuso del metodo DLW migliorando la precisione, riducendo i costi, riducendo le competenze tecniche necessarie per eseguire l'analisi e aumentando la produttività . Lo sviluppo del nuovo strumento sarà eseguito dai nostri partner commerciali, Los Gatos Research, e gli studi di convalida saranno eseguiti presso il campus medico dell'Università del Colorado Anschutz.

In questo lavoro, applicheremo la tecnologia di spettroscopia di assorbimento ultrasensibile di Los Gatos Research, Off-Axis Integrated Cavity Output Spectroscopy (Off-Axis ICOS), per misurare simultaneamente ed economicamente (< $ 50 per campione) 2H, 18O e 17O in campioni di acqua liquida . In breve, in ICOS fuori asse, la luce laser è accoppiata a una cavità ottica in modo fuori asse e viene misurata continuamente in modo simile a un esperimento di assorbimento standard (Figura 1) (1). La cavità fornisce un percorso ottico efficace straordinariamente lungo (ad es. tipicamente 5 - 10 km) consentendo la quantificazione accurata di molecole debolmente assorbenti. Inoltre, poiché il percorso del raggio fuori asse non è univoco, il sistema è estremamente insensibile ai cambiamenti di allineamento, il che lo rende robusto. Questa robustezza combinata con il lungo percorso ottico effettivo consente di misurare gli isotopomeri dell'acqua con altissima precisione. Sin dal suo sviluppo, Los Gatos Research (LGR) e i suoi clienti commerciali hanno eseguito molti esperimenti per convalidare la sensibilità e la robustezza di ICOS fuori asse per misurare una varietà di gas traccia inclusi gli isotopomeri dell'acqua H2O, 1H2HO e H218O (2, 12, 14, 19, 26, 27) e più recentemente isotopomeri dell'acqua nell'urina umana non distillata (3).