Aspetti neurofisiologici, biomolecolari e psicologici del trattamento con Erenumab nell'emicrania cronica

Tale studio è consistito in una prima visita di screening con un Neurologo del Centro Scientifico Cefalee della Fondazione Mondino IRCCS, durante la quale è stata effettuata una visita neurologica e generale completa, e sono stati raccolti i dati raccolti sul diario di routine della cefalea utilizzato da tutti i pazienti che frequentano Fondazione Mondino controllato per confermare i criteri di inclusione/esclusione.

Se un paziente soddisfaceva i criteri, veniva arruolato in un periodo di osservazione di riferimento per un mese. Al termine del periodo di osservazione basale (T0), se i criteri di inclusione/esclusione erano ancora soddisfatti, i pazienti hanno completato le seguenti procedure: registrazione delle caratteristiche cliniche e demografiche, valutazione dei segni vitali, valutazione neurofisiologica e colloquio psicologico basato sul DSM (The Diagnostic and Manuale statico dei disturbi mentali), prelievo di sangue venoso e compilazione di una serie di questionari autosomministrati sullo stato psicologico, sullo stato di salute e sulla qualità della vita.

Al T0, i pazienti sono stati trattati con la prima dose di erenumab 70 mg per via sottocutanea.

Dopo 28 giorni (4 settimane intere), i pazienti sono tornati per la seconda visita (T1) per segnalare variabili cliniche ed eventi avversi. Durante il T1 è stata somministrata la seconda iniezione di erenumab 70 mg, mentre una terza e ultima dose di erenumab 70 mg è stata autosomministrata a domicilio dai pazienti stessi dopo un ulteriore intervallo di 28 giorni (T2). L'ultima visita dello studio (T3) è stata quindi programmata a 56 giorni dal T1, cioè 28 giorni dopo l'ultima dose di erenumab. Al T3, i pazienti sono stati testati con la stessa valutazione multidisciplinare eseguita al T0: registrazione delle caratteristiche cliniche e demografiche, valutazione dei segni vitali, valutazione neurofisiologica, prelievo di sangue venoso e compilazione di questionari riguardanti lo stato psicologico, lo stato di salute e la qualità dei pazienti della vita.

Misurazioni del riflesso di astinenza nocicettiva. Il riflesso di ritiro nocicettivo (NWR) è considerato una tecnica neurofisiologica oggettiva e solida per lo studio della trasmissione nocicettiva spinale. Il riflesso è stato registrato nell'arto inferiore secondo una procedura ben validata, in un ambiente tranquillo da un tecnico esperto tra le 09:00 e le 11:00. I pazienti erano in una posizione comoda con la caviglia flessa a 90° e il ginocchio flesso a 130°. Il nervo surale è stato stimolato elettricamente dietro il malleolo laterale con una coppia di elettrodi di superficie Ag/AgCl. La stimolazione elettrica era composta da 5 impulsi quadrati consecutivi (1 ms, 200 Hz), erogati in modo casuale ogni 60-120 secondi. Lo sweep elettromiografico (Synergy, Medelec, Regno Unito) è stato registrato dalla capitis brevis del bicipite femorale omolaterale con una coppia di elettrodi di superficie Ag/AgCl. È stato utilizzato un metodo a scala per tutte le valutazioni della soglia e l'intensità è stata aumentata di 0,3 mA per gradino. I parametri di registrazione erano: tempo di analisi 300 ms, sensibilità 20 mV e filtro passa banda da 3 a 3000 Hz.

I ricercatori hanno prima valutato la soglia del riflesso di singolo stimolo del NWR (RTh), definita come l'intensità più bassa (mA) in grado di indurre 3 risposte muscolari stabili consecutive di almeno 20 mV e 10 ms. Hanno anche valutato l'AUC (Area Under the Curve - mV x ms) media, la latenza media (ms) e la percezione soggettiva del dolore valutata su una scala analogica visiva da 0 a 10 punti (VAS-RTh).

Quindi i ricercatori hanno valutato la soglia di sommatoria temporale (TST), mediante un treno di 5 stimoli elettrici a una frequenza di 2 Hz. Il TST è stato definito come l'intensità più bassa (mA) in grado di suscitare 3 risposte muscolari stabili consecutive di almeno 20 mV e 10 ms nel quarto e quinto sweep elettromiografico. Hanno anche valutato la percezione soggettiva del dolore del primo (VAS-TST-1) e del quinto (VAS-TST-5) stimolo del TST su una scala analogica visiva da 0 a 10 punti.

Espressione di microRNA. L'espressione del microRNA è stata valutata mediante PCR di trascrizione inversa in tempo reale (RT) in cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC).

Isolamento delle PBMC: i campioni di sangue (10 ml) sono stati raccolti all'interno di una provetta contenente acido etilendiammina tetra-acetico dai partecipanti. I campioni di sangue sono stati diluiti in rapporto 1:1 con tampone fosfato salino (PBS) (Sigma). I campioni di sangue diluiti sono stati caricati lentamente nella soluzione di separazione Ficoll (10 ml) (Sigma) e centrifugati a 800 g per 30 minuti a temperatura ambiente. I PBMC accumulati come monostrato bianco medio sono stati lavati due volte in PBS sterile a 300 g per 15 minuti. Dopo il lavaggio, le PBMC sono state pellettizzate e conservate a -80°C fino al momento dell'uso.

Espressione genica dei microRNA: l'isolamento dell'RNA dai PBMC è stato effettuato utilizzando Direct-zol RNA Mini prep plus (Zymo Research). La concentrazione di RNA è stata determinata mediante assorbanza a 230 e 280 nm utilizzando lo spettrofotometro NanoDrop (Nanodrop™ Thermo Fisher Scientific, Euroclone Milano). La sintesi del cDNA è stata eseguita utilizzando MirXMirna First strand Synthesis (Takara-Diatech, Jesi-An Italy) e TB Green q-Rt PCR (Takara-Diatech, Jesi-An Italy) per determinare i livelli di espressione di miRNA-34a-5p e miRNA-382-5p. La denaturazione è stata eseguita a 95°C e l'amplificazione è stata eseguita mediante cicli in due fasi (95-60°C) per 40 cicli con un sistema di rilevamento RT-PCR dello strumento Light Cycler 480 (Roche, Milano, Italia). I livelli di espressione genica target sono stati normalizzati con U6 (un tipo di piccolo RNA nucleare), utilizzato come gene housekeeping. I livelli di espressione genica sono stati calcolati secondo la formula 2-∆Ct = 2 - (Ct gene - Ct housekeeping gene) utilizzando i valori Ct.

Disabilità e valutazioni psicologiche.

La batteria includeva valutazioni per:

4) Disabilità correlata all'emicrania e caratteristiche associate:

• il test Migraine Disability Assessment (MIDAS): 0-5 (grado I): disabilità minima, 6-10 (grado II): disabilità lieve, 11-20 (grado III): disabilità moderata, 21-40 (grado IVa): disabilità grave, 41 anni e oltre (grado IVb): disabilità molto grave;
• l'Headache Impact Test-6 (HIT-6): 49 o meno: nessun impatto, 50-55: un certo impatto, 56-59: impatto sostanziale, 60-78 impatto grave;
• Scala di valutazione nocicettiva per la valutazione dell'intensità media del dolore emicranico: 0 nessun dolore - 10 molto grave;

• Elenco di controllo dei sintomi dell'allodinia (ASC-12): 0-3: lieve allodinia cutanea, 6-8: moderata allodinia cutanea, 9 e superiori: grave allodinia cutanea.

  5) Qualità della vita:

• il questionario sulla qualità della vita specifico per l'emicrania (MSQ): valutazione di 14 elementi, con ciascun elemento valutato su una scala a 6 punti (che va da "nessuna volta" a "sempre"). I punteggi grezzi vengono quindi trasformati in una scala di 100 punti, con punteggi più alti che indicano una migliore qualità della vita;
• Short Form Health Survey (SF-36): valutazione di 11 item riferita a due sottodomini principali, vale a dire il Mental Component Summary (MCS) e il Physical Component Summary (PCS);

• SALUTE 0-100: ai pazienti è stato chiesto di segnare su una scala da 0 a 100 il loro stato di salute generale nel momento preciso della valutazione.

  6) Stato psicologico:

• Hospital Anxiety and Depression Scale (HADS): un questionario di 14 voci su una scala Likert a 4 punti (0-3) che valuta i sintomi di ansia e depressione. Un punteggio di 8 o superiore nei due diversi domini è considerato significativo per ansia e/o depressione;
• Leeds Dependence Questionnaire (LDQ): uno strumento di 10 item su scala 0-3 per misurare la dipendenza da una varietà di sostanze. Non è stato stabilito alcun punteggio limite indicativo di dipendenza;
• Toronto Alexithymia Scale (TAS-20): un questionario di 20 item su una scala Likert a 5 punti (1-5) che valuta i tratti di alessitimia, cioè la difficoltà degli individui nell'esprimere i propri sentimenti a parole. Un punteggio di 61 o superiore è stato considerato significativo per la presenza di alessitimia;
• Questionario sui traumi infantili: include 13 item riferiti a diversi tipi di traumi infantili che sono stati considerati in termini di numero totale di esperienze traumatiche;
• Questionario sugli eventi di vita stressanti: consiste in un elenco di 58 eventi di vita stressanti (es. trasloco, divorzio, nuovo lavoro, licenziamento, ecc.). Ai pazienti è stato chiesto di spuntare gli eventi accaduti loro negli ultimi 10 anni.