Rigenerazione del muscolo scheletrico nei sopravvissuti a malattie gravi: come prevenire il fallimento delle cellule satelliti? (SATELLITE)

Sfondo:

La debolezza muscolare è una complicanza comune nei pazienti sopravvissuti a gravi malattie o traumi. L'alterazione della forza muscolare e della capacità funzionale peggiora significativamente le prestazioni e la qualità della vita dei pazienti. Non esiste un trattamento specifico e la patogenesi non è ancora del tutto chiara. La sepsi acuta o la risposta infiammatoria estesa sono i principali fattori di rischio per lo sviluppo della debolezza muscolare nei pazienti critici. Recenti studi hanno dimostrato che la debolezza muscolare può essere causata dalla perdita della capacità delle cellule muscolari scheletriche di reagire alla lesione e rigenerarsi. Le cellule satellite del muscolo scheletrico, che sono localizzate sotto la lamina basale delle singole fibre muscolari, sono responsabili della rigenerazione muscolare. Dopo il danno muscolare, le cellule satellite vengono attivate dallo stato di quiescenza (fase G0) ed entrano nel ciclo cellulare (fase G1). Successivamente, proliferano e si differenziano nei mioblasti che poi si fondono e formano miotubi cilindrici multinucleati. Le cellule poi si uniscono nelle miofibrille e si uniscono alle fibre muscolari che non sono state danneggiate. Alcune cellule satellite ritornano allo stato G0 per ricostituire il pool di cellule muscolari scheletriche quiescenti. In risposta al danno cellulare satellite, la biogenesi mitocondriale e la sintesi di nuove proteine ​​miofibrillari vengono attivate per costruire la nuova massa muscolare contenente nuovo contenuto intracellulare. Pertanto, le cellule satellite hanno un ruolo cruciale per la rigenerazione delle fibre muscolari. Studi pilota condotti su modelli animali (ad esempio topi da laboratorio che hanno sviluppato la sepsi acuta) hanno dimostrato una riduzione del contenuto mitocondriale e del DNA, un aumento della produzione di specie reattive dell'ossigeno e cambiamenti nella fosforilazione ossidativa. Le anomalie nel profilo bioenergetico delle cellule satelliti sono considerate una causa della loro ridotta capacità di rigenerarsi. Tuttavia, il meccanismo esatto non è stato ancora del tutto chiarito. Anche i cambiamenti nella struttura mitocondriale e nella dinamica delle cellule satellite nei pazienti critici sono sconosciuti. Negli ultimi anni, l'associazione delle funzioni mitocondriali con la dinamica mitocondriale è stata studiata in varie condizioni patologiche e malattie. A seconda degli insulti esterni e delle richieste metaboliche, i mitocondri subiscono drammatici cambiamenti di forma che possono avere un impatto molto significativo sul metabolismo cellulare. Il processo equilibrato di fissione e fusione mitocondriale svolge un ruolo chiave nella biogenesi mitocondriale e nella rimozione dei mitocondri danneggiati. Il processo è assolutamente necessario per la corretta crescita e funzione del tessuto muscolare. La dinamica e la morfologia mitocondriale possono essere alterate in circostanze patologiche: sotto il lieve stress e la fame, la morfologia mitocondriale può cambiare da piccole sfere o bastoncini corti a lunghi tubuli con una maggiore capacità di fosforilazione ossidativa. D'altra parte, lo stress grave acuto porta a una fissione mitocondriale e a una fosforilazione ossidativa difettosa. Diversi studi condotti su modelli animali hanno dimostrato che le proteine ​​responsabili del processo di fusione e fissione mitocondriale sono assolutamente cruciali per la corretta crescita e funzione delle cellule muscolari scheletriche. Pertanto, le alterazioni della dinamica mitocondriale giocano spesso un ruolo cruciale nella disfunzione del muscolo scheletrico e sono state recentemente ampiamente studiate in diverse miopatie.

In questo progetto, i ricercatori vorrebbero indagare le relazioni causali tra la funzione mitocondriale e la loro forma in cellule satelliti ottenute da pazienti critici nella fase acuta, protratta e post-ICU della malattia critica.

Ipotesi e finalità del progetto:

Alla luce di ciò, i ricercatori ipotizzano che la malattia critica induca danni alle cellule satellite nel muscolo scheletrico che in seguito comprometta il recupero strutturale e funzionale del muscolo scheletrico e contribuisca alla debolezza persistente e al mancato esito funzionale.

Primo, strutturale e funzionale (incl. bioenergetiche) delle cellule satellite saranno confrontate in fase acuta, protratta e post-ICU in pazienti critici rispetto a soggetti di controllo. In secondo luogo, gli investigatori verificheranno l'ipotesi che l'alterazione strutturale e/o funzionale delle cellule satellite sia correlata alla massa muscolare e alla potenza nei sopravvissuti a malattie critiche. In terzo luogo, verranno studiati i fattori che influenzano la bioenergetica e la morfologia mitocondriale delle cellule satelliti (come l'ambiente infiammatorio extracellulare, i farmaci comuni in terapia intensiva, nonché i fattori nutrizionali e anabolici).

Design:

Studio prospettico di coorte con endpoint fisiologici esplorativi.

Materie di studio:

Pazienti in condizioni critiche: sottoposti a ventilazione meccanica da arruolare entro 72 ore dal ricovero, che probabilmente necessiteranno di 7 giorni o più di degenza in terapia intensiva; insorgenza improvvisa di malattia, che può essere determinata nel tempo (come traumi, ictus, arresto cardiaco improvviso ecc.).

Soggetti di controllo: pazienti ortopedici sottoposti a intervento di sostituzione elettiva dell'anca con un performance status da molto buono a eccellente, limitato solo al dolore articolare (ECOG 0).

Procedura di consenso informato:

A tutti i pazienti con capacità verrà chiesto di fornire un potenziale consenso informato scritto. Per i pazienti privi di capacità, si svolgerà una procedura di consenso differito. In questo caso, un medico indipendente esaminerà e firmerà che il paziente è privo di capacità e soddisfa tutti i criteri per essere arruolato nello studio. I parenti prossimi del paziente saranno informati sullo studio non appena possibile con l'ausilio di opuscolo informativo. Al paziente verrà chiesto di fornire e firmare il consenso informato non appena riacquista la capacità di farlo. In caso di rifiuto del consenso, i dati del paziente non saranno utilizzati nell'analisi per protocollo.

Metodi:

Gli approcci metodologici generali da utilizzare sono i seguenti. Punti temporali: i pazienti idonei saranno valutati al basale, dopo 7 giorni e dopo 6 mesi mediante test clinici, test metabolici e biopsie muscolari. In breve, il giorno 0 la massa muscolare sarà valutata utilizzando l'ecografia diagnostica (una misurazione dell'area della sezione trasversale del muscolo retto) e la biopsia del muscolo vasto laterale verrà eseguita utilizzando l'ago di Bergström. Saranno prelevati campioni di sangue basale, il plasma sarà separato e congelato a -80° C per la successiva analisi delle citochine e dei livelli ormonali. I campioni di urina saranno raccolti giornalmente, trattati con toluene e conservati in un congelatore per la successiva determinazione del contenuto di azoto e dei livelli di 3-metil istidina (per calcolare il tasso di catabolismo muscolare e il bilancio dell'azoto). Il giorno 7, tutte le procedure sopra menzionate verranno eseguite nuovamente. Inoltre, ogni volta che il paziente riprende conoscenza, verrà valutata anche la potenza muscolare mediante il punteggio del Medical Research Council (MRC) (test standardizzato della potenza muscolare [0-5] su 12 gruppi muscolari su tutti e 4 gli arti, dando il punteggio 0-60 ( 60 suggerendo una normale potenza muscolare)). Alla dimissione dall'ICU, ai pazienti e ai parenti verrà chiesto di fornire i dettagli di contatto per il follow-up di 6 mesi. Il giorno 180 verranno ripetute tutte le procedure. Inoltre, la sensibilità all'insulina sarà misurata dopo il digiuno notturno mediante clamp euglicemico iperinsulinemico nei giorni 7 e 180.

Esiti clinici: saranno valutati mediante test validati oggettivi come il questionario SF-36 per la valutazione della qualità della vita, il punteggio del Medical Research Council sulla potenza muscolare e il test del cammino di 6 minuti per misurare le prestazioni aerobiche.

Caratteristiche metaboliche: saranno valutate a livello di tutto il corpo mediante clamp eugliceemiche iperinsulinemiche ea livello tissutale mediante biopsie del vasto laterale. La sensibilità all'insulina e l'ossidazione del substrato saranno misurate dopo il digiuno notturno mediante clamp euglicemico iperinsulinemico.

Procedure di laboratorio: ricerca mitocondriale: le biopsie del tessuto muscolare saranno eseguite dal muscolo vasto laterale mediante la tecnica dell'agobiopsia di Bergström. Il campione di ciascuna biopsia sarà separato in tre parti (da 25 a 100 mg ciascuna). Una parte verrà immediatamente congelata in isopentano raffreddato con azoto liquido per la successiva analisi della tipizzazione delle fibre muscolari e l'analisi immunoistochimica. La seconda parte sarà posta nel mezzo di respirazione su ghiaccio per la preparazione degli omogenati e la misurazione su respirometria ad alta risoluzione che consente di determinare la funzione dei singoli complessi respiratori nel contesto citosolico e misurare gli indici metabolici funzionali di base. Verranno principalmente valutate la produzione di ATP, il disaccoppiamento mitocondriale, la capacità della catena di trasporto degli elettroni e la respirazione legata ai singoli complessi. La terza parte sarà utilizzata per l'isolamento e la coltura di cellule muscolari scheletriche. In primo luogo, verranno isolate le cellule satelliti da biopsie utilizzando FACS o biglie magnetiche. Le cellule satelliti saranno coltivate e gli indici mitocondriali globali saranno valutati misurando il tasso di consumo di ossigeno. Questo verrà elaborato con analizzatore di flusso extracellulare o respirometria ad alta risoluzione che consente la misurazione del tasso di consumo di ossigeno e della produzione di lattato in tempo reale. Ciò consente di determinare la produzione di ATP nelle cellule viventi, il disaccoppiamento della membrana mitocondriale interna, la capacità respiratoria massima della catena respiratoria, la capacità glicolitica e l'ossidazione degli acidi grassi o la respirazione legata ai singoli complessi della catena respiratoria. Contemporaneamente verranno misurate le specie reattive dell'ossigeno e il potenziale di membrana mitocondriale. Inoltre, la forma e le dimensioni dei mitocondri, la densità della rete mitocondriale e la disposizione dinamica di questi organelli interconnessi saranno analizzate utilizzando la microscopia confocale a scansione laser nell'imaging di cellule vive. Tutti i parametri saranno studiati nella fase acuta, protratta e post-ICU della malattia critica.