Skeletspierregeneratie bij overlevenden van een kritieke ziekte: hoe kan het falen van satellietcellen worden voorkomen? (SATELLITE)

Achtergrond:

Spierzwakte is een veel voorkomende complicatie bij patiënten die een ernstige kritieke ziekte of trauma hebben overleefd. Veranderde spierkracht en functioneel vermogen verslechteren de prestaties en kwaliteit van leven van de patiënt aanzienlijk. Specifieke behandeling bestaat niet en de pathogenese is nog niet volledig begrepen. Acute sepsis of uitgebreide ontstekingsreactie zijn de belangrijkste risicofactoren voor de ontwikkeling van spierzwakte bij ernstig zieke patiënten. Recente studies hebben aangetoond dat spierzwakte kan worden veroorzaakt door het verlies van het vermogen van skeletspiercellen om op de verwonding te reageren en te regenereren. Satellietcellen van de skeletspier, die gelokaliseerd zijn onder de basale lamina van individuele spiervezels, zijn verantwoordelijk voor spierregeneratie. Na de spierbeschadiging worden satellietcellen geactiveerd vanuit de rusttoestand (G0-fase) en gaan ze de celcyclus in (G1-fase). Vervolgens prolifereren ze en differentiëren ze tot de myoblasten die vervolgens samensmelten en meerkernige cilindrische myotubes vormen. De cellen gaan dan over in de myofibrillen en voegen zich bij de spiervezels die niet beschadigd zijn. Sommige satellietcellen keren terug naar de G0-toestand om de voorraad rustende skeletspiercellen aan te vullen. Als reactie op schade aan satellietcellen worden mitochondriale biogenese en synthese van nieuwe myofibrillaire eiwitten geactiveerd om de nieuwe spiermassa op te bouwen die nieuwe intracellulaire inhoud bevat. Satellietcellen spelen dus een cruciale rol bij de regeneratie van spiervezels. Pilotstudies uitgevoerd op diermodellen (bijv. laboratoriummuizen die acute sepsis ontwikkelden) toonden een vermindering van de mitochondriale inhoud en DNA, verhoogde productie van reactieve zuurstofsoorten en veranderingen in oxidatieve fosforylering aan. De afwijkingen in het bio-energetische profiel van satellietcellen worden beschouwd als een oorzaak van hun verminderde vermogen om te regenereren. Het exacte mechanisme is echter nog niet volledig opgehelderd. Veranderingen in de mitochondriale structuur en dynamiek van satellietcellen bij ernstig zieke patiënten zijn ook onbekend. In de afgelopen jaren is de associatie van mitochondriale functies met mitochondriale dynamiek onderzocht bij verschillende pathologische aandoeningen en ziekten. Afhankelijk van externe beledigingen en metabole eisen, ondergaan mitochondriën dramatische vormveranderingen die een zeer significante invloed kunnen hebben op het cellulaire metabolisme. Het uitgebalanceerde proces van mitochondriale splijting en fusie speelt een sleutelrol in de mitochondriale biogenese en verwijdering van beschadigde mitochondriën. Het proces is absoluut noodzakelijk voor de juiste groei en functie van het spierweefsel. Mitochondriale dynamiek en morfologie kunnen onder pathologische omstandigheden worden gewijzigd: onder milde stress en uithongering kan de mitochondriale morfologie veranderen van kleine bolletjes of korte staven in lange tubuli met een verhoogd vermogen tot oxidatieve fosforylering. Aan de andere kant leidt acute ernstige stress tot een mitochondriale splijting en gebrekkige oxidatieve fosforylering. Verschillende studies uitgevoerd op diermodellen toonden aan dat eiwitten die verantwoordelijk zijn voor het proces van mitochondriale fusie en splijting absoluut cruciaal zijn voor de juiste groei en functie van skeletspiercellen. Daarom spelen veranderingen in de mitochondriale dynamiek vaak een cruciale rol bij skeletspierdisfunctie en zijn recentelijk uitgebreid bestudeerd in verschillende myopathieën.

In dit project willen de onderzoekers de oorzakelijke verbanden onderzoeken tussen de mitochondriale functie en hun vorm in satellietcellen verkregen van ernstig zieke patiënten in de acute, langdurige en post-IC-fase van kritieke ziekte.

Hypothesen en doelstellingen van het project:

In het licht hiervan veronderstellen de onderzoekers dat kritieke ziekte schade veroorzaakt aan satellietcellen in de skeletspieren die later het structurele en functionele herstel van de skeletspieren belemmeren en bijdragen aan aanhoudende zwakte en mislukte functionele resultaten.

Ten eerste, structureel en functioneel (incl. bio-energetische) kenmerken van satellietcellen zullen worden vergeleken in acute, langdurige en post-ICU-fase bij ernstig zieke patiënten vs. controlepersonen. Ten tweede zullen de onderzoekers de hypothese testen dat structurele en/of functionele verandering van satellietcellen samenhangt met grove spiermassa en -kracht bij overlevenden van een kritieke ziekte. Ten derde zullen de factoren die de bio-energetica en de mitochondriale morfologie van satellietcellen beïnvloeden worden bestudeerd (zoals extracellulair ontstekingsmilieu, geneesmiddelen die veel voorkomen op de intensive care, evenals nutritionele en anabole factoren).

Ontwerp:

Prospectieve cohortstudie met verkennende fysiologische eindpunten.

Studie onderwerpen:

Ernstig zieke patiënten: die mechanische beademing krijgen om binnen 72 uur na opname te worden ingeschreven, die waarschijnlijk 7 dagen of langer op de IC moeten blijven; plotseling ontstaan ​​van ziekte, die in de tijd kan worden vastgesteld (zoals trauma, beroerte, plotselinge hartstilstand enz.).

Controleproefpersonen: orthopedische patiënten die een electieve heupvervangende operatie ondergaan met een zeer goede tot uitstekende prestatiestatus, alleen beperkt tot gewrichtspijn (ECOG 0).

Geïnformeerde toestemmingsprocedure:

Alle patiënten met capaciteit zal worden gevraagd om een ​​prospectieve schriftelijke geïnformeerde toestemming te geven. Voor wilsonbekwame patiënten zal een procedure voor uitgestelde toestemming plaatsvinden. In dit geval zal een onafhankelijke clinicus beoordelen en tekenen dat de patiënt onvoldoende capaciteit heeft en dat hij/zij aan alle criteria voldoet om voor het onderzoek te worden ingeschreven. De nabestaanden van de patiënt worden zo spoedig mogelijk geïnformeerd over het onderzoek met behulp van een informatiefolder. De patiënt zal worden gevraagd om geïnformeerde toestemming te geven en te ondertekenen zodra hij/zij hiertoe weer in staat is. In het geval van weigering van toestemming, zullen de gegevens van de patiënt niet worden gebruikt in analyse per protocol.

methoden:

De algemene te gebruiken methodologische benaderingen zijn als volgt. Tijdstippen: Patiënten die in aanmerking komen, worden bij de basislijn, na 7 dagen en na 6 maanden beoordeeld door middel van klinische tests, metabolische tests en spierbiopten. In het kort, op dag 0 zal de spiermassa worden beoordeeld met behulp van diagnostische echografie (een meting van de dwarsdoorsnede van de rectusspier) en zal een biopsie van musculus vastus lateralis worden uitgevoerd met behulp van een Bergström-naald. Baseline bloedmonsters zullen worden genomen, plasma zal worden gescheiden en ingevroren bij -80° C voor de latere analyse van cytokines en hormoonspiegels. Urinemonsters worden dagelijks verzameld, opgedoken met tolueen en opgeslagen in een diepvriesfaciliteit voor latere bepaling van het stikstofgehalte en de 3-methylhistidinespiegels (om de snelheid van spierkatabolisme en de stikstofbalans te berekenen). Op dag 7 worden alle bovengenoemde procedures opnieuw uitgevoerd. Bovendien zal, telkens wanneer de patiënt weer bij bewustzijn komt, ook de spierkracht worden beoordeeld door middel van de Medical Research Council (MRC)-score (gestandaardiseerde test van spierkracht [0-5] op 12 spiergroepen op alle 4 de ledematen, resulterend in een score van 0-60 ( 60 suggereert normale spierkracht)). Bij het ontslag van de IC worden de patiënten en familieleden gevraagd om contactgegevens te verstrekken voor de follow-up van 6 maanden. Op dag 180 worden alle procedures herhaald. Bovendien zal de insulinegevoeligheid worden gemeten na een nacht vasten door hyperinsulinemie euglycemische klem op dag 7 en 180.

Klinische resultaten: worden beoordeeld door middel van objectief gevalideerde tests zoals de SF-36-vragenlijst voor de beoordeling van de kwaliteit van leven, de Medical Research Council-score van spierkracht en een looptest van 6 minuten om de aerobe prestaties te meten.

Metabole kenmerken: worden beoordeeld op het niveau van het hele lichaam door middel van hyperinsulinemische euglycemische klemmen en op weefselniveau door vastus lateralis-biopten. Insulinegevoeligheid en substraatoxidatie zullen worden gemeten na een nacht vasten door hyperinsulinemische euglycemische klem.

Laboratoriumprocedures: mitochondriaal onderzoek: er zullen spierweefselbiopten worden uitgevoerd van de vastus lateralis-spier door middel van Bergström-naaldbiopsietechniek. Het monster van elke biopsie wordt in drie delen gescheiden (van 25-100 mg per elk). Een deel wordt onmiddellijk ingevroren in met vloeibare stikstof gekoelde isopentaan voor latere analyse van typering van spiervezels en immunohistochemische analyse. Het tweede deel zal in het ademhalingsmedium op ijs worden geplaatst voor de bereiding van homogenaten en metingen met hoge resolutie respirometrie, wat het mogelijk maakt om de functie van individuele ademhalingscomplexen in de cytosolische context te bepalen en fundamentele functionele metabole indices te meten. Hoofdzakelijk zullen ATP-productie, mitochondriale ontkoppeling, elektronentransportketencapaciteit en ademhaling gekoppeld aan individuele complexen worden beoordeeld. Het derde deel zal worden gebruikt voor isolatie en kweek van skeletspiercellen. Ten eerste zullen satellietcellen uit biopsieën met behulp van FACS of magnetische bolletjes geïsoleerd worden. De satellietcellen zullen worden gekweekt en de globale mitochondriale indices zullen worden beoordeeld door meting van het zuurstofverbruik. Dit wordt verwerkt met een extracellulaire fluxanalysator of hoge resolutie respirometrie waarmee het zuurstofverbruik en de lactaatproductie in realtime kunnen worden gemeten. Dit maakt het mogelijk om de ATP-productie in levende cellen, de ontkoppeling van de binnenste mitochondriale membraan, de maximale ademhalingscapaciteit van de ademhalingsketen, de glycolytische capaciteit en vetzuuroxidatie of ademhaling gekoppeld aan individuele complexen van de ademhalingsketen te bepalen. Tegelijkertijd zullen reactieve zuurstofsoorten en mitochondriale membraanpotentiaal worden gemeten. Daarnaast zullen vorm en grootte van mitochondria, dichtheid van mitochondriaal netwerk en dynamische opstelling van deze onderling verbonden organellen worden geanalyseerd met behulp van confocale laser scanning microscopie in live-cell imaging. Alle parameters zullen worden bestudeerd in de acute, langdurige en post-IC-fase van kritieke ziekte.