唾液からゲノム DNA を取得するためのプロトコルの設計 (DPOGDNAS)

材料と方法 2.1。 患者 この研究は、国立工科大学の学際的健康科学センター (サント トマス ユニット) の歯周病クリニックで重度の慢性歯周炎と診断された 60 人の患者を対象に実施されました。 この研究のプロトコルは、医学部の研究および生命倫理委員会によって承認されました。 国立工科大学。 インフォームドコンセントは、研究に含まれるすべての参加者から得られ、唾液サンプルの収集とゲノムDNAの抽出を可能にする適切なフォームに署名しました。 ヘルシンキ宣言 (1975 年、最新の更新は 2008 年) によって確立された、人間に関する研究の倫理的規範が厳密に守られました。 各患者は、少なくとも 2 時間前に歯を磨き、何も食べたり飲んだりしないことを含む、唾液サンプリングの準備方法を指示されました。

2.2. サンプルの採取 50 ml のチューブに 10 ml のうがい薬 (Listerine Cool Mint、Johnson & Johnson、21.6% アルコール) を入れました。 患者は、この量のうがい薬で 30 秒間激しく口をすすぎ、チューブに吐き出すように指示されました。 採取したら、サンプルを室温（20°C～24°C）で保存しました。 60 のサンプルを 3 つのグループ (n = 20) に分け、DNA の抽出を別々の時間に行いました。グループ A は 10 日、グループ B は 20 日、グループ C は 30 日です。

2.3. DNA抽出 マウスウォッシュを分離するために、チューブを10750×gで10分間遠心分離した。 上清を注ぎ出し、細胞ペレットを 1 ml の PBS で洗浄し、ボルテックスで 30 秒間再懸濁し、新しい 2 ml チューブに移しました。 次いで、２０００×ｇで５分間遠心分離し、上清を注ぎ出し、ペレットを１．５ｍｌのＰＢＳで洗浄し、ボルテックスで３０秒間再懸濁した。 この溶液に、有核細胞の溶解溶液（Wizard® Genomic DNA Purification Kit）1 ml を加えてから 20 秒間振とうし、続いて 37 °C で 10 分間インキュベートしました。 300 μl のタンパク質沈殿溶液 (Wizard® Genomic DNA Purification Kit) を加えた後、混合物を氷上に 5 分間置き、15000 x g で 3 分間遠心分離しました。 上清を 600 µL の冷イソプロパノールを含む 1.5 ml チューブに入れ、穏やかにホモジナイズした後、15000x で 3 分間遠心分離しました。 上清を注ぎ出し、600 μL の 70% エタノールを新しい調製物に加え、15000 x g で 3 分間遠心分離しました。 上清を注ぎ出し、チューブを室温で完全に乾燥させた。 最後に、100 µL の再水和溶液 (Wizard® Genomic DNA Purification Kit) を加え、混合物を 64 °C で 1 時間インキュベートした後、サンプルを -20 °C で保存して次の処理を待ちました。

2.4. DNA の評価 DNA の濃度と純度の評価は、ACT-GENE ASP-3700 分光計を使用した分光測光法によって決定されました。 DNA の濃度は 260 nm で評価され、純度は 260/203 および 260/280 の比率で推定されました。 ゲノム DNA の完全性は、1% TBE (89 mM トリスホウ酸、89 mM ホウ酸、2 mM EDTA) 中の 0.8% アガロースゲルで電気泳動によって評価され、その後、DNA は Gel-Red で可視化され、UV 光の下で読み取られました。 . 血液サンプルから抽出したDNAをポジティブコントロールとして使用しました。

2.5。 ＰＣＲ ＰＣＲ反応は、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｑｉａｇｅｎキット（Ｎｏ．ｄｅ Ｃａｔ ２０３４４５）を備えたＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ（登録商標）Ｐｅｒｓｏｎａｌ装置で、製造元の指示に従って実施した。 抽出された DNA の品質と種 (ヒト) を確認するために、rs679620 多型 (フォワード 5'- ggg gCT TAA ggC ACA TgA gT-3; リバース 5'- ACT TCg ggA TgC CAg gAA Ag - 3') 用にプライマーを設計しました。 ; Tm: 56°C, 40 サイクル) 485 bp の産物を増幅した。 最終 PCR 産物は 2% アガロースゲルで評価しました。 血液サンプルから抽出した DNA を陽性対照として使用しました。

2.6. シーケンシング 得られた DNA の品質と種をさらに検証するために、製造元の指示に従って、Applied Biosystems 3130 シーケンサーと BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing キットを使用して、PCR から得られた生成物をシーケンシングしました。 データは Geneious バージョン 7.1.3 で分析されました ソフトウェア [23]、NC_000011.10 を使用 配列を参考に。