Diseño de un Protocolo de Obtención de ADN Genómico a Partir de Saliva (DPOGDNAS)

Materiales y métodos 2.1. Pacientes El estudio se realizó con 60 pacientes con diagnóstico de periodontitis crónica severa en la Clínica de Periodoncia del Centro Interdisciplinario de Ciencias de la Salud (Unidad Santo Tomás), Instituto Politécnico Nacional. El protocolo de este estudio fue aprobado por el Comité de Investigación y Bioética de la Facultad de Medicina. Instituto Politécnico Nacional. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes incluidos en el estudio, quienes firmaron el formulario correspondiente que permitía la recolección de muestras de saliva y la extracción de ADN genómico. Se siguieron estrictamente las normas éticas para la investigación en seres humanos, establecidas por la Declaración de Helsinki (1975; actualizada por última vez en 2008). A cada paciente se le indicó cómo prepararse para la toma de muestras de saliva, lo que implicaba cepillarse los dientes al menos 2 h antes y abstenerse de comer o beber cualquier cosa.

2.2. Toma de muestra En un tubo de 50 ml se colocaron 10 ml de enjuague bucal (Listerine Cool Mint, Johnson & Johnson, 21,6% alcohol). Se instruyó a los pacientes para que se enjuagaran la boca enérgicamente con esta cantidad de enjuague bucal durante 30 s y luego la escupieran en el tubo. Una vez recolectadas, las muestras se almacenaron a temperatura ambiente (20°C - 24°C). Las 60 muestras se dividieron en 3 grupos (n=20), y la extracción de ADN se realizó en distintos momentos: grupo A a los 10 días, grupo B a los 20 días y grupo C a los 30 días.

2.3. Extracción de ADN Para separar el colutorio, el tubo se centrifugó durante 10 min a 10750x g. Se vertió el sobrenadante y el sedimento celular se lavó con 1 ml de PBS, se resuspendió en el vortex durante 30 s y se transfirió a un tubo nuevo de 2 ml. Luego se centrifugó durante 5 min a 2000x g, se vertió el sobrenadante y el sedimento se lavó con 1,5 ml de PBS y se resuspendió en el vortex durante 30 s. A esta solución se le añadió 1 ml de solución de lisis de células nucleadas (Wizard® Genomic DNA Purification Kit) antes de agitar durante 20 s, seguido de incubación a 37 °C durante 10 min. Después de agregar 300 µl de solución de precipitador de proteínas (Kit de purificación de ADN genómico Wizard®), la mezcla se colocó en hielo durante 5 min y luego se centrifugó a 15000x g durante 3 min. El sobrenadante se colocó en un tubo de 1,5 ml que contenía 600 µL de isopropanol frío y se homogeneizó suavemente, luego se centrifugó a 15000x durante 3 min. Se vertió el sobrenadante y se añadieron 600 µL de etanol al 70% a una preparación fresca, que se centrifugó a 15000x g durante 3 min. Se vertió el sobrenadante y se secó completamente el tubo a temperatura ambiente. Finalmente, se agregaron 100 µL de solución de rehidratación (Kit de purificación de ADN genómico Wizard®) y la mezcla se incubó a 64 °C durante 1 h antes de almacenar las muestras a -20 °C a la espera de su posterior procesamiento.

2.4. Evaluación del ADN La evaluación de la concentración y pureza del ADN se determinó mediante espectrofotometría con un espectrómetro ACT-GENE ASP-3700. La concentración de ADN se evaluó a 260 nm, mientras que la pureza se estimó con las relaciones 260/203 y 260/280. La integridad del ADN genómico se evaluó en un gel de agarosa al 0,8 % en TBE al 1 % (Tris Borato 89 mM, ácido bórico 89 mM, EDTA 2 mM) mediante electroforesis, y luego se visualizó el ADN con Gel-Red y se leyó bajo luz ultravioleta. . El ADN extraído de muestras de sangre se utilizó como control positivo.

2.5. PCR La reacción de PCR se llevó a cabo en un equipo Eppendorf Mastercycler® Personal con el kit HotStarTaq® Master Mix Qiagen (No. de Cat 203445), siguiendo las instrucciones del fabricante. Para verificar la calidad y especie (humana) del ADN extraído, se diseñaron cebadores para el polimorfismo rs679620 (forward 5´- ggg gCT TAA ggC ACA TgA gT-3; reverse 5´- ACT TCg ggA TgC CAg gAA Ag - 3´ ; Tm: 56°C, 40 ciclos) que amplificó un producto de 485 pb. El producto PCR final se evaluó con un gel de agarosa al 2%. El ADN extraído de muestras de sangre se utilizó como control positivo.

2.6. Secuenciación Para verificar aún más la calidad y especie del ADN obtenido, el producto resultante de la PCR se secuenció con un secuenciador Applied Biosystems 3130 y el kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing, siguiendo las instrucciones del fabricante. Los datos fueron analizados con Geneious versión 7.1.3 software [23], usando el NC_000011.10 secuencia como referencia.