Projeto de um protocolo para obtenção de DNA genômico da saliva (DPOGDNAS)

Materiais e métodos 2.1. Doentes O estudo foi realizado com 60 doentes diagnosticados com periodontite crónica grave na Clínica de Periodontia do Centro Interdisciplinar de Ciências da Saúde (Unidade Santo Tomás), Instituto Politécnico Nacional. O protocolo deste estudo foi aprovado pelo Comitê de Pesquisa e Bioética da Faculdade de Medicina. Instituto Politécnico Nacional. O consentimento informado foi obtido de todos os participantes incluídos no estudo, que assinaram o formulário apropriado permitindo a coleta de amostras de saliva e a extração de DNA genômico. As normas éticas para pesquisas com seres humanos, estabelecidas pela Declaração de Helsinki (1975; atualizada mais recentemente em 2008) foram rigorosamente seguidas. Cada paciente foi instruído sobre como se preparar para a coleta de saliva, que envolvia escovar os dentes pelo menos 2 horas antes e abster-se de comer ou beber qualquer coisa.

2.2. Colheita da amostra Em um tubo de 50 ml foram colocados 10 ml de colutório (Listerine Cool Mint, Johnson & Johnson, álcool 21,6%). Os pacientes foram instruídos a enxaguar a boca vigorosamente com essa quantidade de enxaguatório bucal durante 30 segundos e depois cuspi-lo no tubo. Uma vez coletadas, as amostras foram armazenadas em temperatura ambiente (20°C - 24°C). As 60 amostras foram divididas em 3 grupos (n=20), e a extração do DNA foi realizada em tempos distintos: grupo A aos 10 dias, grupo B aos 20 dias e grupo C aos 30 dias.

2.3. Extração de DNA Para separar o bochecho, o tubo foi centrifugado durante 10 min a 10750x g. O sobrenadante foi derramado e o sedimento celular lavado com 1 ml de PBS, ressuspenso no vórtex por 30 segundos e transferido para um novo tubo de 2 ml. Em seguida, foi centrifugado por 5 min a 2000x g, o sobrenadante vertido e o pellet lavado com 1,5 ml de PBS e ressuspenso no vórtex por 30 s. A esta solução foi adicionado 1 ml de solução de lise de células nucleadas (Wizard® Genomic DNA Purification Kit) antes de ser agitado por 20 s, seguido de incubação a 37 °C por 10 min. Após a adição de 300 µl de solução precipitadora de proteínas (Wizard® Genomic DNA Purification Kit), a mistura foi colocada no gelo por 5 min e então centrifugada a 15000x g por 3 min. O sobrenadante foi colocado em um tubo de 1,5 ml contendo 600 µL de isopropanol frio e homogeneizado suavemente, depois centrifugado a 15000x por 3 min. O sobrenadante foi derramado e 600 µL de etanol 70% foram adicionados a uma preparação fresca, que foi centrifugada a 15000x g por 3 min. O sobrenadante foi derramado e o tubo foi completamente seco à temperatura ambiente. Finalmente, 100 µL de solução de reidratação (Wizard® Genomic DNA Purification Kit) foi adicionado e a mistura foi incubada a 64 °C por 1 h antes de armazenar as amostras a -20 °C para aguardar processamento posterior.

2.4. Avaliação do DNA A avaliação da concentração e pureza do DNA foi determinada por espectrofotometria com um espectrômetro ACT-GENE ASP-3700. A concentração de DNA foi avaliada em 260 nm, enquanto a pureza foi estimada com as razões de 260/203 e 260/280. A integridade do DNA genômico foi avaliada em um gel de agarose 0,8% em TBE 1% (89 mM Tris Borato, 89 mM ácido bórico, 2 mM EDTA) por eletroforese e, em seguida, o DNA foi visualizado com Gel-Red e lido sob luz ultravioleta . O DNA extraído de amostras de sangue foi usado como controle positivo.

2.5. PCR A reação de PCR foi realizada em um aparelho Eppendorf Mastercycler® Personal com o kit HotStarTaq ® Master Mix Qiagen (No. de Cat 203445), seguindo as instruções do fabricante. Para verificar a qualidade e espécie (humana) do DNA extraído, foram desenhados primers para o polimorfismo rs679620 (forward 5´- ggg gCT TAA ggC ACA TgA gT-3; reverse 5´- ACT TCg ggA TgC CAg gAA Ag - 3´ ; Tm: 56°C, 40 ciclos) que amplificou um produto de 485 pb. O produto final da PCR foi avaliado com um gel de agarose a 2%. O DNA extraído de amostras de sangue foi usado como controle positivo.

2.6. Sequenciamento Para posterior verificação da qualidade e espécie do DNA obtido, o produto resultante da PCR foi sequenciado com sequenciador Applied Biosystems 3130 e kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing, seguindo as instruções do fabricante. Os dados foram analisados ​​com o Geneious versão 7.1.3 software [23], usando o NC_000011.10 sequência como referência.