台湾における遺伝子型耐性HIV株

2008年から2009年にかけて、国立台湾大学病院でHIV治療を受けた連続HIV-1感染患者から血液サンプルが採取される。 抗レトロウイルス治療歴のない患者から 100 例、治療経験のある患者から 100 例を収集する予定です。 標準化された症例収集フォームは、人口統計、臨床的特徴、および血漿 HIV RNA 量 (PVL) や CD4 細胞数などの検査結果のデータを記録するために使用されます。 ＰＶＬは、製造業者のプロトコールに従って、Ｃｏｂａｓ Ａｍｐｌｉｃｏｒ ＨＩＶ－１ ＭｏｎｉｔｏｒＴＭ Ｔｅｓｔ、バージョン１．５（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国インディアナポリス）によって定量化される。 CD4 細胞数は、FACSFlow (Becton Dickinson) を使用して測定されます。 この研究は病院の治験審査委員会によって承認されました。

社内の遺伝子型薬剤耐性試験は、プロテアーゼ、逆転写酵素、およびインテグラーゼに焦点を当てて、HIV-1 pol 遺伝子の薬剤耐性プロファイルを決定するために実行されます。 薬剤耐性変異は、国際エイズ協会-米国コンセンサスの薬剤耐性変異リストに従って、スタンフォード大学 HIV 薬剤耐性データベース (http://hivdb.stanford.edu) の HIVdb プログラムを使用して特定されます。ガイドライン[24]。 主要な薬剤耐性をコードするアミノ酸残基に野生型配列と変異配列の遺伝的混合物を有する株は、薬剤耐性があると見なされます。 HIVdb プログラムによって与えられる解釈に基づいて、配列は、高、中、低レベルの耐性を持つと解釈される薬剤耐性配列と、感受性があり潜在的に耐性があると解釈される感受性配列に分類されます。 多剤耐性 (MDR) は、複数のクラスの抗レトロウイルス薬に対して遺伝子型耐性を持つものとして定義されます。 さまざまなサブタイプおよび組換え体の参照配列は、ロス アラモス データベース (http://hiv-web.lanl.gov/seq-db.html) から取得されます。 配列は、わずかな手動調整を行って、MEGA (分子進化遺伝学解析) 分析パッケージ (バージョン 3.0) [25] にリストされている Clustal W と整列します。 系統樹は、MEGA ソフトウェアにリストされている木村 2 パラメーター距離行列に基づいて隣接結合法によって構築されます。 1,000 回の複製のうち 750 を超えるブートストラップ値は重要であるとみなされます。

インテグラーゼ遺伝子に特異的または固有のアミノ酸変異を持つ人の表現型は、社内の表現型アッセイを使用して決定されます。 簡単に説明すると、p7 から vif までのフラグメント (約 3.6 kb) が患者の血漿ウイルス RNA から増幅され、バックボーン ウイルス クローンにクローン化されます (図 1)。 得られたクローンを 293 細胞にトランスフェクトして感染性ウイルスを生成します。その力価は p24 アッセイによって決定され、続いて等量のウイルスを使用して健康なドナーからの PBMC を感染させます。 試験化合物の存在下または非存在下での感染後 3、5、および 7 日後の感染細胞からの上清中のウイルス力価は、リアルタイム PCR または p24 アッセイによって決定されます。 上清ウイルスコピーの 50% を減少させるのに必要な化合物の最小濃度 (EC50) は、リアルタイム PCR または p24 アッセイから生成された用量反応曲線の回帰分析によって計算されます。