Genotypisch resistente HIV-stammen in Taiwan

Van 2008 tot 2009 zullen bloedmonsters worden verzameld van opeenvolgende met hiv-1 geïnfecteerde patiënten die hiv-zorg hebben gekregen in het National Taiwan University Hospital. We verwachten 100 gevallen te verzamelen die antiretroviraal naïef zijn en 100 gevallen die eerder zijn behandeld. Er zal een gestandaardiseerd formulier voor het verzamelen van gevallen worden gebruikt om gegevens over demografische en klinische kenmerken en laboratoriumresultaten, zoals plasma HIV RNA load (PVL) en CD4-celtellingen, vast te leggen. PVL zal worden gekwantificeerd door de Cobas Amplicor HIV-1 MonitorTM Test, versie 1.5, (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, VS) volgens het protocol van de fabrikant. Het aantal CD4-cellen zal worden bepaald met behulp van FACSFlow (Becton Dickinson). Deze studie werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van het ziekenhuis.

De interne genotypische geneesmiddelresistentietest zal worden uitgevoerd om de geneesmiddelresistentieprofielen voor het hiv-1-pol-gen te bepalen, met de nadruk op protease, reverse transcriptase en integrase. Geneesmiddelresistentiemutaties zullen worden geïdentificeerd met behulp van het HIVdb-programma van de Stanford University HIV Drug Resistance Database (http://hivdb.stanford.edu), in overeenstemming met de drugresistentiemutatielijst van de International AIDS Society-USA Consensus Richtlijnen [24]. Stammen met genetische mengsels van wildtype en mutante sequenties op aminozuurresiduen die coderen voor grote geneesmiddelresistentie, zullen als geneesmiddelresistent worden beschouwd. Op basis van de interpretatie die door het HIVdb-programma wordt gegeven, zullen sequenties worden onderverdeeld in de geneesmiddelresistente sequenties, geïnterpreteerd als hebbende hoge, gemiddelde en lage niveaus van resistentie, en de gevoelige sequenties, geïnterpreteerd als de gevoelige en potentieel resistente. Multidrugresistentie (MDR) wordt gedefinieerd als het hebben van genotypische resistentie tegen meer dan één klasse antiretrovirale geneesmiddelen. Referentiesequenties van verschillende subtypes en recombinanten zullen worden opgehaald uit de Los Alamos-database (http://hiv-web.lanl.gov/seq-db.html). Sequenties zullen worden uitgelijnd met de Clustal W die wordt vermeld in het analytische pakket MEGA (molecular evolutionary genetics analysis) (versie 3.0) [25] met kleine handmatige aanpassingen. De fylogenetische bomen zullen worden geconstrueerd door middel van de buurverbindingsmethode op basis van de Kimura 2-parameter afstandsmatrix vermeld in de MEGA-software. Bootstrap-waarden groter dan 750 van 1.000 herhalingen worden als significant beschouwd.

Het fenotype van degenen met een specifieke of unieke aminozuurmutatie op het integrase-gen zal worden bepaald met behulp van een interne fenotypische test. In het kort, het fragment van p7 tot vif, ongeveer 3,6 kb, zal worden geamplificeerd uit plasma viraal RNA van patiënten en gekloneerd in onze backbone virale kloon (Figuur 1). De resulterende klonen zullen worden getransfecteerd in 293-cellen om infectieuze virussen te produceren, waarvan de titers zullen worden bepaald door middel van een p24-assay en gelijke hoeveelheden virussen zullen vervolgens worden gebruikt om PBMC van gezonde donoren te infecteren. Virustiters in de supernatanten van geïnfecteerde cellen na 3, 5 en 7 dagen na infectie in aanwezigheid of afwezigheid van geteste verbindingen zullen worden bepaald door middel van real-time PCR of p24-assay. De minimale concentratie van verbindingen die nodig is om 50% van supernatant virale kopieën (EC50) te verminderen, zal worden berekend door regressieanalyse van de dosis-responscurven gegenereerd uit real-time PCR of p24-assay.