Genotypiska resistenta HIV-stammar i Taiwan

Från 2008 till 2009 kommer blodprover att samlas in från på varandra följande HIV-1-infekterade patienter som fått HIV-vård på National Taiwan University Hospital. Vi räknar med att samla in 100 fall som är antiretrovirala naiva och 100 fall som är behandlingserfarna patienter. Ett standardiserat fallinsamlingsformulär kommer att användas för att registrera data om demografiska och kliniska egenskaper och laboratorieresultat, såsom plasma HIV RNA-belastning (PVL) och CD4-cellantal. PVL kommer att kvantifieras av Cobas Amplicor HIV-1 MonitorTM Test, version 1.5, (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, USA) enligt tillverkarens protokoll. Antalet CD4-celler kommer att bestämmas med FACSFlow (Becton Dickinson). Denna studie godkändes av sjukhusets institutionella granskningsnämnd.

Det interna genotypiska läkemedelsresistenstestet kommer att utföras för att bestämma läkemedelsresistensprofilerna för HIV-1 pol-genen, med fokus på proteas, omvänt transkriptas och integras. Läkemedelsresistensmutationer kommer att identifieras med användning av HIVdb-programmet i Stanford Universitys HIV Drug Resistance Database (http://hivdb.stanford.edu), i enlighet med listan över läkemedelsresistensmutationer från International AIDS Society-USA Consensus Riktlinjer [24]. Stammar med genetiska blandningar av vildtyps- och mutantsekvenser vid aminosyrarester som kodar för större läkemedelsresistens kommer att anses vara läkemedelsresistenta. Baserat på den tolkning som HIVdb-programmet ger kommer sekvenser att delas upp i de läkemedelsresistenta sekvenserna, tolkade som att de har höga, mellanliggande och låga nivåer av resistens, och de känsliga sekvenserna, tolkade som de känsliga och potentiellt resistenta. Multi-drug resistens (MDR) kommer att definieras som att ha genotypisk resistens mot mer än en klass av antiretrovirala läkemedel. Referenssekvenser av olika undertyper och rekombinanter kommer att hämtas från Los Alamos-databasen (http://hiv-web.lanl.gov/seq-db.html). Sekvenser kommer att anpassas till Clustal W som anges i MEGA (molekylär evolutionär genetikanalys) analytiska paket (version 3.0) [25] med mindre manuella justeringar. De fylogenetiska träden kommer att konstrueras med hjälp av grannsammanfogningsmetoden baserad på Kimura 2-parameters avståndsmatris som listas i MEGA-mjukvaran. Bootstrap-värden som är större än 750 av 1 000 replikat anses signifikanta.

Fenotypen för de med specifik eller unik aminosyramutation vid integrasgenen kommer att bestämmas med hjälp av intern fenotypisk analys. Kortfattat kommer p7 till vif-fragmentet, cirka 3,6 kb, att amplifieras från patienternas virala plasma-RNA och klonas in i vår virala ryggradsklon (Figur 1). De resulterande klonerna kommer att transfekteras in i 293-celler för att producera infektiösa virus, vars titrar kommer att bestämmas genom p24-analys och lika mängder virus kommer därefter att användas för att infektera PBMC från friska donatorer. Virustitrar i supernatanterna från infekterade celler efter 3, 5 och 7 dagar efter infektion i närvaro eller frånvaro av testade föreningar kommer att bestämmas med realtids-PCR eller p24-analys. Den minimala koncentrationen av föreningar som krävs för att reducera 50 % av supernatantviruskopiorna (EC50) kommer att beräknas genom regressionsanalys av dos-responskurvorna genererade från realtids-PCR- eller p24-analys.