Ceppi di HIV genotipici resistenti a Taiwan

Dal 2008 al 2009, verranno raccolti campioni di sangue da pazienti con infezione da HIV-1 consecutivi che hanno ricevuto cure per l'HIV presso il National Taiwan University Hospital. Prevediamo di raccogliere 100 casi che sono naïve agli antiretrovirali e 100 casi che sono pazienti con esperienza di trattamento. Verrà utilizzato un modulo di raccolta dei casi standardizzato per registrare i dati demografici e le caratteristiche cliniche e i risultati di laboratorio, come il carico plasmatico di HIV RNA (PVL) e la conta delle cellule CD4. Il PVL sarà quantificato dal test Cobas Amplicor HIV-1 MonitorTM, versione 1.5, (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, USA) secondo il protocollo del produttore. La conta delle cellule CD4 sarà determinata utilizzando FACSFlow (Becton Dickinson). Questo studio è stato approvato dall'Institutional Review Board dell'ospedale.

Il test di resistenza ai farmaci genotipico interno verrà eseguito per determinare i profili di resistenza ai farmaci per il gene pol dell'HIV-1, concentrandosi su proteasi, trascrittasi inversa e integrasi. Le mutazioni di resistenza ai farmaci saranno identificate con l'uso del programma HIVdb dell'HIV Drug Resistance Database della Stanford University (http://hivdb.stanford.edu), in accordo con l'elenco delle mutazioni di resistenza ai farmaci dell'International AIDS Society-USA Consensus Linee guida [24]. I ceppi con miscele genetiche di sequenze wild-type e mutanti nei residui amminoacidici che codificano per la maggiore resistenza ai farmaci saranno considerati resistenti ai farmaci. Sulla base dell'interpretazione fornita dal programma HIVdb, le sequenze saranno suddivise in sequenze farmaco-resistenti, interpretate come aventi livelli di resistenza alti, intermedi e bassi, e sequenze sensibili, interpretate come sensibili e potenzialmente resistenti. La resistenza multifarmaco (MDR) sarà definita come resistenza genotipica a più di una classe di farmaci antiretrovirali. Sequenze di riferimento di vari sottotipi e ricombinanti saranno recuperate dal database di Los Alamos (http://hiv-web.lanl.gov/seq-db.html). Le sequenze saranno allineate con il Clustal W elencato nel pacchetto analitico MEGA (molecular evolutionary genetics analysis) (versione 3.0) [25] con piccoli aggiustamenti manuali. Gli alberi filogenetici saranno costruiti con il metodo del neighbor-joining basato sulla matrice di distanza Kimura a 2 parametri elencata nel software MEGA. I valori Bootstrap superiori a 750 su 1.000 repliche sono considerati significativi.

Il fenotipo di quelli con mutazione aminoacidica specifica o unica nel gene dell'integrasi sarà determinato utilizzando un test fenotipico interno. In breve, il frammento da p7 a vif, di circa 3,6 kb, sarà amplificato dall'RNA virale plasmatico dei pazienti e clonato nel nostro clone virale della spina dorsale (Figura 1). I cloni risultanti saranno trasfettati in 293 cellule per produrre virus infettivi, i cui titoli saranno determinati mediante saggio di p24 e quantità uguali di virus saranno successivamente utilizzate per infettare PBMC da donatori sani. I titoli virali nei supernatanti delle cellule infette dopo 3, 5 e 7 giorni dopo l'infezione in presenza o in assenza dei composti testati saranno determinati mediante real-time PCR o p24 assay. La concentrazione minima di composti necessaria per ridurre del 50% le copie virali supernatanti (EC50) sarà calcolata mediante analisi di regressione delle curve dose-risposta generate da real-time PCR o p24 assay.