Genotypowo oporne szczepy HIV na Tajwanie

W latach 2008-2009 próbki krwi będą pobierane od kolejnych pacjentów zakażonych wirusem HIV-1, którzy otrzymali opiekę związaną z HIV w Narodowym Szpitalu Uniwersyteckim na Tajwanie. Spodziewamy się zebrać 100 przypadków, którzy nie byli wcześniej leczeni przeciwretrowirusowo i 100 pacjentów, którzy byli wcześniej leczeni. Standaryzowany formularz zbierania przypadków będzie używany do rejestrowania danych demograficznych i cech klinicznych oraz wyników badań laboratoryjnych, takich jak miano HIV RNA w osoczu (PVL) i liczba komórek CD4. PVL będzie oznaczane ilościowo za pomocą testu Cobas Amplicor HIV-1 MonitorTM, wersja 1.5, (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, USA) zgodnie z protokołem producenta. Liczbę komórek CD4 określa się stosując FACSFlow (Becton Dickinson). Badanie to zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board szpitala.

Wewnętrzny test genotypowej lekooporności zostanie przeprowadzony w celu określenia profili lekooporności dla genu pol HIV-1, ze szczególnym uwzględnieniem proteazy, odwrotnej transkryptazy i integrazy. Mutacje lekooporności zostaną zidentyfikowane przy użyciu programu HIVdb bazy danych HIV Drug Resistance Database Uniwersytetu Stanforda (http://hivdb.stanford.edu), zgodnie z listą mutacji lekooporności sporządzoną przez International AIDS Society-USA Consensus Wytyczne [24]. Szczepy z genetycznymi mieszankami sekwencji typu dzikiego i zmutowanych w resztach aminokwasowych, które kodują główną lekooporność będą uważane za lekooporne. Na podstawie interpretacji podanej przez program HIVdb sekwencje zostaną podzielone na sekwencje lekooporne, interpretowane jako posiadające wysoki, średni i niski poziom oporności oraz sekwencje wrażliwe, interpretowane jako wrażliwe i potencjalnie oporne. Oporność wielolekowa (MDR) zostanie zdefiniowana jako oporność genotypowa na więcej niż jedną klasę leków przeciwretrowirusowych. Sekwencje referencyjne różnych podtypów i rekombinantów zostaną pobrane z bazy danych Los Alamos (http://hiv-web.lanl.gov/seq-db.html). Sekwencje zostaną wyrównane z Clustal W wymienionym w pakiecie analitycznym MEGA (analiza genetyki ewolucyjnej molekularnej) (wersja 3.0) [25] z niewielkimi korektami ręcznymi. Drzewa filogenetyczne zostaną zbudowane metodą łączenia sąsiadów w oparciu o 2-parametrową macierz odległości Kimura wymienioną w oprogramowaniu MEGA. Wartości Bootstrap większe niż 750 z 1000 powtórzeń są uważane za znaczące.

Fenotyp osób ze specyficzną lub unikalną mutacją aminokwasową w genie integrazy zostanie określony za pomocą wewnętrznego testu fenotypowego. Pokrótce, fragment p7 do vif, około 3,6 kb, zostanie zamplifikowany z wirusowego RNA pacjentów z osocza i sklonowany do naszego szkieletowego klonu wirusowego (ryc. 1). Powstałe klony zostaną transfekowane do komórek 293 w celu wytworzenia zakaźnych wirusów, których miana zostaną określone w teście p24, a następnie równe ilości wirusów zostaną użyte do zakażenia PBMC od zdrowych dawców. Miana wirusa w supernatantach z zakażonych komórek po 3, 5 i 7 dniach od zakażenia w obecności lub nieobecności badanych związków zostaną określone za pomocą PCR w czasie rzeczywistym lub testu p24. Minimalne stężenie związków wymagane do zmniejszenia o 50% supernatantu kopii wirusa (EC50) zostanie obliczone przez analizę regresji krzywych dawka-odpowiedź wygenerowanych z PCR w czasie rzeczywistym lub testu p24.