台湾的基因型抗性 HIV 毒株

从 2008 年到 2009 年，将从连续在台大医院接受 HIV 护理的 HIV-1 感染患者采集血样。 我们预计将收集 100 例未接受过抗逆转录病毒治疗的患者和 100 例接受过治疗的患者。 标准化的病例收集表将用于记录人口统计数据和临床特征以及实验室结果，例如血浆 HIV RNA 载量 (PVL) 和 CD4 细胞计数。 PVL 将根据制造商的方案通过 Cobas Amplicor HIV-1 MonitorTM 测试 1.5 版（Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，USA）进行量化。 使用 FACSFlow (Becton Dickinson) 确定 CD4 细胞计数。 本研究经医院机构审查委员会批准。

将进行内部基因型耐药性测试以确定 HIV-1 pol 基因的耐药性概况，重点是蛋白酶、逆转录酶和整合酶。 根据国际艾滋病协会-美国共识的耐药突变列表，将使用斯坦福大学艾滋病毒耐药数据库（http://hivdb.stanford.edu）的HIVdb程序识别耐药突变指南[24]。 在编码主要耐药性的氨基酸残基处具有野生型和突变序列的遗传混合物的菌株将被认为是耐药的。 根据HIVdb程序给出的解释，序列将分为耐药序列，解释为具有高、中、低水平的耐药性，以及敏感序列，解释为敏感和潜在耐药。 多重耐药性 (MDR) 将被定义为对一种以上的抗逆转录病毒药物具有基因型耐药性。 将从洛斯阿拉莫斯数据库 (http://hiv-web.lanl.gov/seq-db.html) 检索各种亚型和重组体的参考序列。 序列将与 MEGA（分子进化遗传学分析）分析包（3.0 版）[25] 中列出的 Clustal W 对齐，并进行少量手动调整。 系统发育树将通过基于MEGA软件中列出的Kimura 2参数距离矩阵的邻接法构建。 Bootstrap 值大于 1,000 次重复中的 750 次被认为是重要的。

在整合酶基因处具有特定或独特氨基酸突变的那些的表型将使用内部表型测定来确定。 简而言之，p7 至 vif 片段（约 3.6kb）将从患者的血浆病毒 RNA 中扩增并克隆到我们的主干病毒克隆中（图 1）。 所得克隆将被转染到293细胞中以产生感染性病毒，其滴度将通过p24测定来确定，随后将等量的病毒用于感染来自健康供体的PBMC。 在存在或不存在测试化合物的情况下，感染后 3、5 和 7 天后感染细胞上清液中的病毒滴度将通过实时 PCR 或 p24 测定法确定。 减少 50% 上清液病毒拷贝所需的最低化合物浓度 (EC50) 将通过实时 PCR 或 p24 测定生成的剂量-反应曲线的回归分析来计算。