대만의 유전형 저항성 HIV 변종

2008년부터 2009년까지 국립 대만 대학 병원에서 HIV 치료를 받은 연속적인 HIV-1 감염 환자로부터 혈액 샘플을 채취할 예정입니다. 항레트로바이러스 치료 경험이 없는 환자 100명과 치료 경험이 있는 환자 100명을 수집할 것으로 예상합니다. 표준화된 사례 수집 양식을 사용하여 혈장 HIV RNA 로드(PVL) 및 CD4 세포 수와 같은 인구 통계 및 임상 특성 및 실험실 결과 데이터를 기록합니다. PVL은 제조업체의 프로토콜에 따라 Cobas Amplicor HIV-1 MonitorTM 테스트 버전 1.5(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, USA)로 정량화됩니다. CD4 세포 수는 FACSFlow(Becton Dickinson)를 사용하여 결정됩니다. 이 연구는 병원의 기관 검토 위원회(Institutional Review Board)의 승인을 받았습니다.

사내 유전자형 약물 내성 시험은 HIV-1 pol 유전자에 대한 약물 내성 프로파일을 결정하기 위해 수행되며 프로테아제, 역전사 효소 및 인테그라제에 초점을 맞춥니다. International AIDS Society-USA Consensus의 약물 저항성 돌연변이 목록에 따라 Stanford University HIV Drug Resistance Database(http://hivdb.stanford.edu)의 HIVdb 프로그램을 사용하여 약물 저항성 돌연변이를 확인합니다. 지침 [24]. 주요 약물 내성을 코딩하는 아미노산 잔기에서 야생형 및 돌연변이 서열의 유전적 혼합물을 갖는 균주는 약물 내성인 것으로 간주될 것이다. HIVdb 프로그램의 해석에 따라 염기서열은 높은, 중간, 낮은 수준의 내성을 갖는 것으로 해석되는 약물 내성 염기서열과 민감하고 잠재적으로 내성이 있는 것으로 해석되는 민감성 염기서열로 구분됩니다. 다제내성(MDR)은 한 종류 이상의 항레트로바이러스 약물에 대한 유전자형 내성을 갖는 것으로 정의됩니다. 다양한 아형 및 재조합체의 참조 서열은 Los Alamos 데이터베이스(http://hiv-web.lanl.gov/seq-db.html)에서 검색됩니다. 시퀀스는 MEGA(분자 진화 유전학 분석) 분석 패키지(버전 3.0)[25]에 나열된 Clustal W와 약간의 수동 조정으로 정렬됩니다. 계통 발생 수는 MEGA 소프트웨어에 나열된 Kimura 2 매개 변수 거리 행렬을 기반으로 이웃 결합 방법으로 구성됩니다. 1,000회 복제 중 750보다 큰 부트스트랩 값은 중요한 것으로 간주됩니다.

인테그라제 유전자에 특이적 또는 독특한 아미노산 돌연변이가 있는 사람들의 표현형은 사내 표현형 분석을 사용하여 결정됩니다. 간단히 말해서, 약 3.6kb의 p7에서 vif 단편이 환자의 혈장 바이러스 RNA에서 증폭되어 백본 바이러스 클론으로 복제됩니다(그림 1). 생성된 클론은 293 세포에 형질감염되어 감염성 바이러스를 생산할 것이며, 역가는 p24 분석으로 결정되고 동일한 양의 바이러스가 이후에 건강한 기증자로부터 PBMC를 감염시키는 데 사용될 것입니다. 시험 화합물의 존재 또는 부재 하에 감염 후 3, 5 및 7일 후 감염된 세포로부터의 상청액의 바이러스 역가는 실시간 PCR 또는 p24 검정에 의해 결정될 것이다. 상청액 바이러스 카피(EC50)의 50%를 감소시키는 데 필요한 화합물의 최소 농도는 실시간 PCR 또는 p24 분석에서 생성된 용량-반응 곡선의 회귀 분석으로 계산됩니다.