Genotypové rezistentní kmeny HIV na Tchaj-wanu

Od roku 2008 do roku 2009 budou odebírány vzorky krve od po sobě jdoucích pacientů infikovaných HIV-1, kterým byla poskytnuta péče o HIV v National Taiwan University Hospital. Očekáváme, že shromáždíme 100 případů, kteří dosud nebyli antiretrovirovými léky, a 100 případů, kteří jsou již léčenými pacienty. Pro záznam demografických a klinických charakteristik a laboratorních výsledků, jako je plazmatická HIV RNA zátěž (PVL) a počty buněk CD4, bude použit standardizovaný formulář pro sběr případu. PVL bude kvantifikováno pomocí testu Cobas Amplicor HIV-1 MonitorTM, verze 1.5, (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, USA) podle protokolu výrobce. Počet buněk CD4 bude stanoven pomocí FACSFlow (Becton Dickinson). Tato studie byla schválena Institucionální revizní radou nemocnice.

Bude proveden vlastní test genotypové lékové rezistence pro stanovení profilů lékové rezistence pro HIV-1 pol gen se zaměřením na proteázu, reverzní transkriptázu a integrázu. Mutace lékové rezistence budou identifikovány pomocí programu HIVdb databáze HIV lékové rezistence Stanfordské univerzity (http://hivdb.stanford.edu), v souladu se seznamem mutací lékové rezistence konsensu International AIDS Society-USA Pokyny [24]. Kmeny s genetickými směsmi sekvencí divokého typu a mutantních sekvencí na aminokyselinových zbytcích, které kódují hlavní lékovou rezistenci, budou považovány za odolné vůči lékům. Na základě interpretace poskytnuté programem HIVdb budou sekvence rozděleny na sekvence rezistentní vůči léčivům, interpretované jako sekvence s vysokou, střední a nízkou úrovní rezistence, a sekvence citlivé, interpretované jako citlivé a potenciálně rezistentní. Mnohočetná léková rezistence (MDR) bude definována jako genotypová rezistence na více než jednu třídu antiretrovirových léků. Referenční sekvence různých podtypů a rekombinantů budou získány z databáze Los Alamos (http://hiv-web.lanl.gov/seq-db.html). Sekvence budou sladěny s Clustal W uvedeným v analytickém balíčku MEGA (analýza molekulární evoluční genetiky) (verze 3.0) [25] s drobnými manuálními úpravami. Fylogenetické stromy budou konstruovány metodou sousedského spojování na základě Kimura 2-parametrové matice vzdálenosti uvedené v softwaru MEGA. Hodnoty bootstrapu vyšší než 750 z 1 000 replikátů jsou považovány za významné.

Fenotyp jedinců se specifickou nebo jedinečnou aminokyselinovou mutací v genu integrázy bude stanoven pomocí interního fenotypového testu. Stručně řečeno, fragment p7 to vif, přibližně 3,6 kb, bude amplifikován z pacientovy plazmatické virové RNA a klonován do našeho virového klonu páteře (obrázek 1). Výsledné klony budou transfekovány do buněk 293 za vzniku infekčních virů, jejichž titry budou stanoveny testem p24 a stejná množství virů budou následně použita k infekci PBMC od zdravých dárců. Titry viru v supernatantech z infikovaných buněk po 3, 5 a 7 dnech po infekci v přítomnosti nebo nepřítomnosti testovaných sloučenin budou stanoveny pomocí PCR v reálném čase nebo testem p24. Minimální koncentrace sloučenin potřebná ke snížení 50 % virových kopií supernatantu (EC50) se vypočte regresní analýzou křivek dávka-odpověď vytvořených z PCR v reálném čase nebo z testu p24.