Genotyyppiresistentit HIV-kannat Taiwanissa

Vuosina 2008–2009 verinäytteitä kerätään peräkkäisiltä HIV-1-tartunnan saaneilta potilailta, jotka ovat saaneet HIV-hoitoa Taiwanin kansallisessa yliopistollisessa sairaalassa. Odotamme keräävämme 100 tapausta, jotka eivät ole aiemmin saaneet antiretroviraalista lääkitystä, ja 100 tapausta, jotka ovat kokeneita hoitoa saaneita potilaita. Standardoitua tapausten keruulomaketta käytetään demografisten ja kliinisten ominaisuuksien sekä laboratoriotulosten, kuten plasman HIV-RNA-kuorman (PVL) ja CD4-solujen määrän, tallentamiseen. PVL kvantifioidaan Cobas Amplicor HIV-1 MonitorTM -testillä, versio 1.5, (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, USA) valmistajan protokollan mukaisesti. CD4-solujen määrä määritetään käyttämällä FACSFlow'ta (Becton Dickinson). Tämän tutkimuksen hyväksyi sairaalan Institutional Review Board.

Oma genotyyppinen lääkeresistenssitesti suoritetaan HIV-1-pol-geenin lääkeresistenssiprofiilien määrittämiseksi keskittyen proteaasiin, käänteiskopioijaentsyymiin ja integraasiin. Lääkeresistenssimutaatiot tunnistetaan käyttämällä Stanfordin yliopiston HIV-lääkeresistenssitietokannan HIVdb-ohjelmaa (http://hivdb.stanford.edu) International AIDS Societyn ja USA:n konsensuksen lääkeresistenssimutaatioluettelon mukaisesti. Suuntaviivat [24]. Kantojen, joissa on geneettisiä sekoituksia villityypin ja mutanttisekvenssien aminohappotähdeissä, jotka koodaavat suurta lääkeresistenssiä, katsotaan olevan lääkeresistenttejä. HIVdb-ohjelman antaman tulkinnan perusteella sekvenssit jaetaan lääkeresistenteiksi sekvensseiksi, joiden tulkitaan olevan korkea, keskitasoinen ja matala resistenssitaso, ja herkkiin sekvensseihin, jotka tulkitaan herkiksi ja mahdollisesti resistenteiksi. Monilääkeresistenssillä (MDR) määritellään genotyyppiresistenssi useammalle kuin yhdelle antiretroviraalisten lääkkeiden luokalle. Eri alatyyppien ja rekombinanttien viitesekvenssit haetaan Los Alamos -tietokannasta (http://hiv-web.lanl.gov/seq-db.html). Sekvenssit kohdistetaan MEGA-analyysipaketissa (molecular evolutionary genetics analysis) lueteltuun Clustal W:hen (versio 3.0) [25] pienin manuaalisin säätöin. Fylogeneettiset puut rakennetaan naapuriliitosmenetelmällä MEGA-ohjelmiston Kimura 2-parametrin etäisyysmatriisin perusteella. Bootstrap-arvoja, jotka ovat suurempia kuin 750 1 000 toistosta, pidetään merkittävinä.

Niiden, joilla on spesifinen tai ainutlaatuinen aminohappomutaatio integraasigeenissä, fenotyyppi määritetään käyttämällä talon sisäistä fenotyyppimääritystä. Lyhyesti sanottuna p7-vif-fragmentti, noin 3,6 kb, monistetaan potilaiden plasman virus-RNA:sta ja kloonataan runkovirusklooniimme (kuvio 1). Tuloksena saadut kloonit transfektoidaan 293-soluihin tarttuvien virusten tuottamiseksi, joiden tiitterit määritetään p24-määrityksellä ja yhtä suuria määriä viruksia käytetään myöhemmin terveiltä luovuttajilta peräisin olevien PBMC:iden infektoimiseen. Virustiitterit infektoitujen solujen supernatanteissa 3, 5 ja 7 päivän kuluttua infektiosta testattujen yhdisteiden läsnä ollessa tai ilman niitä määritetään reaaliaikaisella PCR- tai p24-määrityksellä. Yhdisteiden vähimmäispitoisuus, joka vaaditaan vähentämään 50 % supernatanttiviruskopioista (EC50), lasketaan regressioanalyysillä annos-vastekäyristä, jotka on muodostettu reaaliaikaisesta PCR:stä tai p24-määrityksestä.