Генотипически устойчивые штаммы ВИЧ на Тайване

С 2008 по 2009 годы образцы крови будут собираться у последовательно инфицированных ВИЧ-1 пациентов, получавших лечение в связи с ВИЧ в больнице Национального Тайваньского университета. Мы рассчитываем собрать 100 случаев, которые ранее не получали антиретровирусную терапию, и 100 пациентов, ранее получавших лечение. Для записи данных о демографических и клинических характеристиках, а также лабораторных результатов, таких как нагрузка РНК ВИЧ в плазме (PVL) и количество клеток CD4, будет использоваться стандартная форма для сбора данных о случаях заболевания. PVL будет количественно определяться тестом Cobas Amplicor HIV-1 MonitorTM, версия 1.5 (Roche Diagnostics Corporation, Индианаполис, США) в соответствии с протоколом производителя. Количество клеток CD4 будет определяться с использованием FACSFlow (Becton Dickinson). Это исследование было одобрено Институциональным наблюдательным советом больницы.

Внутренний генотипический тест на лекарственную устойчивость будет проводиться для определения профилей лекарственной устойчивости для гена pol ВИЧ-1 с упором на протеазу, обратную транскриптазу и интегразу. Мутации лекарственной устойчивости будут идентифицированы с использованием программы HIVdb Базы данных лекарственной устойчивости Стэнфордского университета (http://hivdb.stanford.edu) в соответствии со списком мутаций лекарственной устойчивости Международного общества по СПИДу и Консенсуса США. Руководство [24]. Штаммы с генетическими смесями последовательностей дикого типа и мутантных последовательностей по аминокислотным остаткам, которые кодируют большую лекарственную устойчивость, будут считаться лекарственно-устойчивыми. На основе интерпретации, данной программой HIVdb, последовательности будут разделены на последовательности, устойчивые к лекарственным средствам, интерпретируемые как имеющие высокий, промежуточный и низкий уровни устойчивости, и чувствительные последовательности, интерпретируемые как чувствительные и потенциально устойчивые. Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) определяется как наличие генотипической устойчивости более чем к одному классу антиретровирусных препаратов. Эталонные последовательности различных подтипов и рекомбинантов будут получены из базы данных Лос-Аламоса (http://hiv-web.lanl.gov/seq-db.html). Последовательности будут приведены в соответствие с Clustal W, указанным в аналитическом пакете MEGA (анализ молекулярной эволюционной генетики) (версия 3.0) [25] с небольшими ручными корректировками. Филогенетические деревья будут построены методом объединения соседей на основе двухпараметрической матрицы расстояний Кимуры, указанной в программном обеспечении MEGA. Значения начальной загрузки, превышающие 750 из 1000 повторов, считаются значительными.

Фенотип тех, у кого есть специфическая или уникальная аминокислотная мутация в гене интегразы, будет определяться с помощью внутреннего фенотипического анализа. Вкратце, фрагмент p7-vif размером около 3,6 т.п.н. будет амплифицирован из вирусной РНК плазмы пациентов и клонирован в наш основной вирусный клон (рис. 1). Полученные клоны будут трансфицированы в клетки 293 для получения инфекционных вирусов, титры которых будут определяться с помощью анализа p24, и впоследствии равные количества вирусов будут использованы для заражения РВМС от здоровых доноров. Титры вируса в супернатантах инфицированных клеток через 3, 5 и 7 дней после инфицирования в присутствии или в отсутствие тестируемых соединений будут определять с помощью ПЦР в реальном времени или анализа р24. Минимальная концентрация соединений, необходимая для уменьшения количества копий вируса в супернатанте на 50% (EC50), будет рассчитываться с помощью регрессионного анализа кривых доза-реакция, полученных с помощью ПЦР в реальном времени или анализа p24.